Studieren Wechselwirkungen von<em> Staphylococcus aureus</em> Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

Neutrophile (PMN) sind professionelle Fresszellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der angeborenen Immunantwort gegen Staphylococcus aureus ^1. Der ständige Kampf zwischen Wirt und Mikrobe hat zu einem Wettrüsten der beiden führte. Kürzlich, community-associated (CA) Stämme von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) sind entstanden, die zu sein scheinen sehr effizient in Umgehung der neutrophilen Tötung ^2,3. Übermäßige Phenol löslich modulin (PSMs) Produktion von CA-MRSA hat mit höherer Virulenz ^4,5 in Verbindung gebracht. Humanneutrophilen können diese PSMs über FPR2 die Aktivierung dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptor ⁶ führen zu erkennen. Eines der frühesten Ereignisse ist die Mobilisierung von intrazellulären Speichern von Calcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} wirkt als sekundärer Botenstoff für eine Vielzahl von Effektor-Funktionen von PMNs einschließlich Degranulation und Phagozytose ^7. Daher Ca ^{2 +} ist ein sehr empfindlicher Indikator für dieFunktionsfähigkeit PSMs zu PMN aktivieren. Um die Auswirkungen von PSM auf Neutrophilen studieren, werden frische Neutrophilen isoliert und mit einem Farbstoff, der auf Calcium Mobilisierung fluoresziert geladen. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisierung gemessen werden kann. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die direkte Auswirkungen von toxischen und anderen Komponenten auf Neutrophilen zu untersuchen und festzustellen, die niedrigste Konzentration, bei der diese aktiv sind. Für uns ist es ein sehr nützliches Werkzeug, um die Wirkung von vielen Proteinen von S. produziert studieren aureus in Immunevasion wie FPR2 hemmende Protein (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ und Chemotaxis hemmende Protein von Staphylococcus aureus (CHIPS) ⁹ beteiligt. All diese Proteine ​​haben gezeigt, dass das Calcium-Mobilisierung in Neutrophilen durch Bindung an den Rezeptor erkennt den Agonisten zu hemmen.

Vor kurzem hat unsere Gruppe beschrieben, dass PSMs funktionell gehemmt durch Serumlipoproteine ^{​​10 <}/ Sup>. Diese Lipoproteine ​​sind reichlich vorhanden im Blut und menschlichem Gewebe, was darauf hinweist, dass ihre Funktion ausüben PSMs vor allem in der intrazellulären Umgebung. Die Verfügbarkeit der Calciummobilisierung Assay erlaubt uns die präzise Messung der Wirkung von Serum-Lipoproteine ​​auf Aktivierung von Neutrophilen durch den PSM durch die erhebliche Hemmung durch sehr geringe Konzentrationen an Serum angegeben.

Da die PSMs funktionell gehemmt durch Serum, stellten wir die Hypothese, dass es eine wichtige Funktion für PSMs als intrazelluläre Toxine. Wir haben daher versucht, die Rolle der PSMs nach Phagozytose bestimmen. Um die Expression der PSMs in den interzellulären Raum zu untersuchen, haben wir Reporter Fusionen von dem Promotor des Operons psmα GFP konstruiert. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile wurden phagozytiert wurde die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet ^10. Offensichtlich kann diese technique ermöglicht die Untersuchung der Expression einer Vielzahl von Genen in S. aureus oder anderen Erregern nach Phagozytose. Da für S. aureus Überleben in der interzellulären Nische ist sehr wichtig, um das angeborene Immunsystem ^{11 10 12} zu überwinden, die Untersuchung der Rolle von Genen in dieser Nische aktiviert ist von großer Bedeutung für das Verständnis ihrer Virulenz.