Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme
Summary
Alphaherpes virüs enfeksiyonlarının Canlı hücre görüntüleme yönelik ulaşım ve hücreler arası yayılma dinamik olayların analizi sağlar. Burada, birincil nöronların enfeksiyon sırasında viral meclislerinin görselleştirme kolaylaştırmak için floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar kullanmak yöntemleri sunuyoruz.
Abstract
Canlı hücre floresan mikroskopi teknikleri, hem de floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar yapımında gelişmeler taşıma ve nöron alphaherpes virüs enfeksiyonunun yayılmasını gerçek zamanlı görsel sağladı. Canlı hücre görüntüleme ile birlikte viral membran, zar ve capsids için yeni floresan füzyon proteinlerin programı, akson içinde ulaşım geçiren viral partikül meclisleri tespit. Benzer araçları başarıyla hücreler arasında iletilen virionlann sayısı ve çeşitliliği ölçmek için viral parçacıkların yayılması, hücre-hücre analizi için kullanılmıştır. Önemlisi, anterograd ulaşım ve yayılma canlı hücre görüntüleme teknikleri parçacık taşıma hızları, parçacıkların dağılımları, ve protein yerelleştirme zamansal analizleri de dahil olmak üzere bilgi hazinesi üretmek. Klasik viral genetik teknikleri yanı sıra, bu yöntem kritik bilgiler sağladıönemli mekanik soruları. Bu yazıda ayrıntılı olarak alphaherpes virüs taşıma ve yayılmasının temel sorulara cevap için geliştirilmiştir görüntüleme yöntemleri açıklar.
Introduction
Alphaherpes herpes simpleks virüsü gibi virüsler (HSV) -1, -2, ve pseudorabies virüs periferik sinir sistemi (PNS) enfeksiyon (PRV) viral yaşam döngüsü boyunca çeşitli karmaşık ve oldukça düzenli bir adımdan oluşur. PNS nöronlar içinde Ulaştırma primer viral enfeksiyon ve sonraki arası ana yayılma hem de olaylar sırasında önemlidir. Viral yaşam döngüsü iki bileşeni modüle moleküler mekanizmalar; uzak akson (ileriye taşıma) ve duyarlı hücreleri (ileriye yayılması) için virionlar sonraki iletim içinde hücre organlarından viral meclislerin yönettiği taşıma anlayışı herpes patogenezinde için önemlidir.
Nöronlarda viral parçacıkların taşıma ve çıkış olgun bir bulaşıcı virion 1,2 montajı bağlıdır. Immünofloresan (eğer varsa) ve elektron mikroskopisi (EM) dahil olmak üzere, daha önceden belirlenmiş deneyleri, parçacık montaj durumu ve prot incelemek için kullanılmıştırein etkileşimleri virion ulaşım ve yayılması 3-6 ile ilişkilidir. Ancak kimyasal sabitleme tarafından tanıtıldı taşıma virionların ve deneysel eserler dinamik yapısı sabit görüntülerin 7,8 yorumlanması eleştirilmiştir. Son zamanlarda, viral floresan füzyon proteinleri bir dizi protein fonksiyonu üzerinde ihmal edilebilir etkilere sahip HSV ve PRV için tarif edilmiştir. Kapsid, zar ve glikoprotein 9-11: Yeşil floresan proteini (GFP) ve Kırmızı floresan proteinleri (mCherry veya MRFP) fluorophores genellikle olgun bir virionun üç yapısal bileşenlerinin iki görüntüleme sağlamak için eşleştirilmiş. Çift etiketli virüs kullanarak ileriye taşıma hücre görüntüleme Canlı taşıma sırasında viral parçacıkların montaj durumunu görüntüler. Viral suşlar ifade Benzer florofor sayısı ve yayılma 12,13 aşağıdaki viral genomların çeşitliliği görselleştirmek için kullanılır. Floresan proteinleri özellikleri (14,15 gözden) büyük ölçüde etkileyebilirviral veya cep meclisleri görselleştirmek için yeteneği. Yabani tip işlevselliği korunması için yeni bir protein füzyonları, tasarımı ve test kendi kendine etkileşimleri ve kararlılığı dahil floresan protein içsel özellikleri, dikkate alınmalıdır.
Floresan proteini füzyon, iki in vitro hücre kültürü sistemlerinde iyi karakterize ile birlikte herpes virüsü enfeksiyonu canlı hücre görüntüleme için kullanılır: ayrışmış 16 ve 17 (Şekil 1A) sıçan üstün servikal ganglion (SCG) nöronlar bölümlere. Her iki sistemde de, embriyonik SCG en tek hücre gövdeleri için ayrışmış, disseke edilir ve in vitro kültür 18 için kaplama. SCG nöronlar otonom sinir sisteminin bir parçasıdır ve kolayca olgun bir polarize devlet ex vivo olarak kültür ve nöronal büyüme faktörü (NGF) ile ayırt edilebilir. Ayrışmış SCG nöronlar f sağlayan akson uzun bir ağ oluşturmakya da anterograd ulaşım 6 geçmesi gibi viral parçacıkların görselleştirme. Bölümlere SCG kültürler nöronal hücre gövdesi (S bölmesi) ve distal akson Termini (N bölmesi) 19 akışkan izolasyonu sağlar. Orijinal 20 veya modifiye Campenot odaları 17 ile bölümlere nöronların yapımı ve kullanımı için ayrıntılı protokoller bir dizi daha önce yayınlanmıştır. Akışkan izolasyon nöronal hücre gövdeleri ve izole akson Termini ulaşım sonra döl virionlar tespit seçici enfeksiyonu için izin verir. Enfeksiyon öncesi termini üzerinde epitel hücreleri kaplama viral enfeksiyonun yayılması için alıcı hücreler içerir.
Orada tüm canlı hücre görüntüleme deney için önemli birçok temel unsurlardır, ama bizim protokoller için en uygun olan: otomatik görüntü elde etme, floresan aydınlatma, görüntüleme hızı ve çevre kontrolü. Tüm görüntüleme deneyleri için, kullandığımızters, otomatik, Epifloresans aydınlatma mikroskobu (Şekil 1B). Mikroskop Nikon Eclipse Ti tabanı etrafında inşa ve hızlı bir şekilde yeniden otomatik görüntü alımı sırasında mikroskop için bilgisayar kontrollü motorlu sistemleri bir dizi istihdam etmektedir. Floresan aydınlatma için, aydınlatma yol boyunca nötral yoğunluk filtreleri ile zayıflatılmış olabilir geniş spektrumlu cıva ark lambası kullanın. Tahrik olma filtreleri floresan aydınlatma spektrum sınırlamak ve çok geçişli çift renkli aynalar ve floresan emisyon filtreleri özel floresan bileşikler görselleştirmek ile eşleştirilmiş. Uyarma ve emisyon filtreleri farklı floresan kanalların hızlı sıralı satın sağlamak için bağımsız, hızlı geçiş filtresi tekerlekler monte edilmiştir. Görüntü elde etme hızını daha düşük yoğunluklu sinyal ve kısa görüntü kez okundu tespiti için yararlı bir hassas ve hızlı EM-CCD kamera, ile geliştirilmiştir. Microsc üzerinde çevresel kontrolyerdir kuluçka ısıtılmış bir aşamada üst ve nemlendirilmiş bir CO2 ile zenginleştirilmiş bir atmosfer inkübatör içine geçirilir ise yüksek ısılarda örnekleri korumak için bir objektif lens ısıtıcı ile elde edilir. Mikroskop yakın 25 kadar muhafaza ortam sıcaklığı ile karanlık bir odada tutulur ° C ve tüm pencereler karartma perdeleri ile minimize dış ışık. Aşağıdaki protokoller ileriye taşıma ve yayılması deneyleri için bu sistemin kullanımını tarif eder.
Alternatif bir dizi canlı hücre görüntüleme değişkenleri kontrol etmek için var. Mikroskopi ayarları kontrol elle ya da özel bir yazılım bağımlı otomatik sistemleri ile yapılabilir. Floresan aydınlatma, halojen, LED veya lazer kaynağı ile elde edilebilir. Görüntüleme hızı filtre anahtarlama hızını ve eşleştirilmiş algılama sistemi ile sinyal görselleştirmek için zaman değiştirilir. Çevre kontrolü mi üzerindeki özel donanım ile elde edilebilircroscope sahne, tamamını veya bir ısıtmalı ve nemlendirilmiş kutusuna mikroskop bir parçası, ya da mikroskop yapılacaktır oda sıcaklığı yükseltmek yoluyla bir muhafaza. Bu alternatiflerin her biri maliyet ve performans ile ilgili avantajları ve dezavantajları vardır.
Sonraki protokol, detay rekombinant viral suşlar aracılığıyla hızlı ileriye taşıma ve alphaherpes virüslerin ileriye yayılmasını incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı. Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme kapsid, zar ve / veya akson 11 içinde ulaşım geçiren dinamik yapılara glikoprotein co-lokalizasyon görüntüler. Bölümlere nöronal kültürlerin bir gecede timelapse görüntüleme duyarlı hücrelerin 12 aksonal virionu çıkış ve enfeksiyon görüntüler. Burada sunulan protokolleri bizim özellikle görüntüleme sistemi ile kullanım için optimize edilmiş, ancak canlı hücre görüntüleme dört elementin göre geniş anlamda sunulmuştur. TartışmasındaDaha fazla ayrıntı deney başarılı için gerekli olan optimizasyon bazı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu gözlem eylemi ile önemli değişiklik olmadan ortaya gibi canlı hücre görüntüleme amacı biyolojik süreçleri izlemektedir. Çevre kontrolü, görüntüleme hızı ve floresan aydınlatma: Bu amaç, üç değişken optimize ederek elde edilir. Bu arası bağımlı değişkenler uygun görüntüleme koşulları elde etmek için dengeli olmalıdır. Sunulan protokol temsili sonuçlar üretmek için özel koşullar kullanmaktadır. Biz kısaca sunulan özel yöntemler ayrıntılarına geçmeden önce çevresel k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LWE ve RK Sağlık hibe R37 NS033506-16 ve R01 NS060699-03, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir. MPT bir Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu (PF-10-057-01-MPC) tarafından desteklenmiştir. Dr Matthew Lyman ve Dr Oren Kobiler bir tavsiye ve bilgi mikroskop yapılandırma ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri tasarımında etkili olmuştur. Ayrıca mikroskop satın alma, kurulum ve performans teknik yardım için Neal Barlow ve Nikon Araçların Brian T. Kain için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch’ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch’ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
