Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis.

El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un ^1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión ^3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas ^7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína ^9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación ^12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en ^14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje.

En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados en sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado ¹⁶ y compartimentada ¹⁷ (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron en el cultivo in vitro ^18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado ^6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) ^19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con ²⁰ originales o modificadas Campenot cámaras ¹⁷ se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral.

Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO ₂ enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación.

Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento.

En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones ^11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles ^12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.