Живая изображений Сотовые Alphaherpes Вирус Антероградный транспорта и распространения

Инфекция периферической нервной системы (ПНС) на alphaherpes вирусов, таких как вирус простого герпеса (ВПГ) -1, -2, и вирус псевдобешенства (PRV) включает в себя несколько сложных и строго регулируется шаги в течение жизненного цикла вируса. Транспортировка в нейроны ПНС имеет решающее значение во время событий первичной вирусной инфекции и последующего между хозяином распространения. Молекулярных механизмов, которые регулируют два компонента жизненного цикла вируса, направленного транспорта вирусной сборки от клеточных тел в аксоны (антероградной транспорта) и последующей передачи вирионов в чувствительные клетки (антероградной распространению) имеют важное значение для понимания патогенеза вируса герпеса.

Транспорта и выход вирусных частиц в нейронах зависит от сборки зрелых инфекционных ^1,2 вириона. Ранее фиксированная анализов, в том числе иммунофлюоресценции (ИФ) и электронной микроскопии (ЭМ), были использованы для изучения состояния частиц сборки и протЭйн-взаимодействий, связанных с транспортом и распространении вириона ^3-6. Однако динамичный характер транспортировки вирионов и экспериментальные артефакты введен химической фиксации посрамлены интерпретации неподвижных изображений в ^7,8. В последнее время количество вирусных-флуоресцентных слитых белков были описаны для HSV и PRV, которые имеют незначительное воздействие на функцию белка. Зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (mCherry или MRFP) флуорофоров часто в паре, чтобы позволить отображение двух из трех структурных компонентов зрелых вирионов: капсид, оболочки и гликопротеин ^9-11. Живых изображений сотовый антероградной транспорта с использованием двойного меченых вирусов визуализирует состояние сборки вирусных частиц во время транспортировки. Похожие флуорофором выразив вирусные штаммы используются для визуализации число и разнообразие вирусных геномов после распространения ^12,13. Свойств флуоресцентных белков (см. обзор в ^14,15) в значительной степени влияютвозможность визуализации вирусными или клеточными сборок. Внутренние свойства флуоресцентного белка, в том числе самостоятельно взаимодействий и стабильности, следует учитывать при разработке и тестировании нового белка слияния для сохранения дикого типа функциональности.

В сочетании с флуоресцентным белком слияния, два хорошо известных в системах пробирке культуру клеток используют для изображений живых клеток герпетической инфекции: диссоциированными ¹⁶ и разобщенным ¹⁷ (рис. 1А) крысы верхний шейный ганглий (SCG) нейронов. В обеих системах, эмбриональные SCG являются рассеченные, диссоциирован на одну клетку тела, и высевают для культивирования в пробирке ^18. SCG нейронов являются частью вегетативной нервной системы и могут быть легко культивировать и дифференцированы по нейронной фактора роста (NGF) в зрелую поляризованного естественных условиях бывшего государства. Диссоциированных нейронов SCG образуют разветвленную сеть аксонов, который позволяет Fили визуализации вирусные частицы, поскольку они подвергаются антероградной транспорта ^6. Разобщенным SCG культур обеспечивают гидравлической изоляции нейронов клетки тела (S ящиком) и дистальных концах аксона (N ящиком) ^19. Ряд подробных протоколов для построения и использования обособленных нейронов с использованием оригинальных ²⁰ или модифицированный Campenot камер ¹⁷ были опубликованы ранее. Гидравлической изоляции обеспечивает селективное инфекции тела нейронов и обнаружение вирионы потомства после транспортировки к изолированным концах аксона. Покрытие эпителиальных клеток над Термини до инфицирования обеспечивает клетки-реципиента для распространения вирусной инфекции.

Есть много важных элементов, важных для всех живых изображений экспериментов клетки, но наиболее актуальными для нашей протоколы: автоматизированный сбор изображений, флуоресцентное освещение, скорость визуализации и экологического контроля. Для всех изображений экспериментов, мы используемперевернутый, автоматизированные, эпифлуоресцентной микроскопом освещения (рис. 1В). Микроскоп построена вокруг Nikon Затмение Ti базы и использует ряд контролируемых компьютером моторизованных систем быстро перенастроить микроскопом во время автоматизированного захвата изображений. Для флуоресцентной подсветкой, мы используем широкий спектр ртутных ламп, которые могут быть ослаблены с фильтры нейтральной плотности вдоль освещения пути. Возбуждение фильтры ограничивают спектр флуоресцентного освещения и когда в паре с многоходовой дихроичных зеркал и флуоресцентных фильтров выбросов визуализировать конкретные флуоресцентные соединения. Возбуждения и излучения фильтры установлены в независимое, быстрое переключение фильтра колеса для быстрого последовательного приобретения различных флуоресцентных каналов. Скорость получения изображения еще более усиливается с чувствительной и быстрой EM-CCD камеры, полезны для обнаружения сигналов низкой интенсивности и малой изображение время чтения. Экологический контроль на MicroscОПЕ достигается со сценой верхней нагревается инкубатора и объективной линзы нагреватель для поддержания образцов при повышенных температурах при влажной и CO ₂ атмосфере, обогащенной передается в инкубаторе. Микроскоп хранится в затемненной комнате с температурой окружающей среды поддерживается около 25 ° C и внешнего освещения минимизированы плотные шторы на всех окнах. Следующие протоколы описывают использование этой системы для антероградной транспорта и распространение анализов.

Число альтернатив существуют для контроля за переменными изображений живых клеток. Контролем микроскопа настройки может быть выполнена вручную или с помощью автоматических систем зависит от собственного программного обеспечения. Флуоресценция освещения может быть достигнута галогеном, светодиод или лазерных источников. Скорость визуализации модифицируют скорость переключения фильтра и время вывода сигнала с парными системы обнаружения. Экологический контроль может быть достигнут с специализированное оборудование на Мимикроскопе этапе, закрытый со всех или части микроскопа в подогретый и увлажненный ящика, или путем повышения температуры в помещении, где микроскопии будет выполнена. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и недостатки, связанные с затратами и производительностью.

В последующем протоколе, мы подробно использование изображений живых клеток для изучения быстрого антероградной транспорта и антероградной alphaherpes распространение вирусов с использованием рекомбинантных вирусных штаммов. В режиме реального времени изображений живых клеток визуализирует капсида, оболочки, и / или гликопротеина совместной локализации на динамических структурах проходят аксоны транспорта в пределах ^11. Ночевка интервальная съемка изображений из обособленных нейронов культур визуализирует аксональное выхода вирионов и заражение восприимчивых клетках ^12. Протоколы, представленные здесь, были оптимизированы для использования с нашей конкретной системы визуализации, но представлены в широком смысле по отношению к четырем элементам изображений живых клеток. В ходе обсуждения мыбудет более подробно некоторые оптимизации, которые необходимы для успешного экспериментирования.