تصوير الخلايا الحية من الهربسي الألفائي الفيروسات النقل تقدمي وانتشارها
Summary
تصوير الخلايا الحية من العدوى بالفيروس الهربسي الألفائي تمكن من تحليل للأحداث دينامية النقل الموجهة وانتشار بين الخلايا. هنا، فإننا نقدم المنهجيات التي تستخدم سلالات فيروسية المؤتلف معربا عن البروتينات الانصهار الفلورسنت لتسهيل التصور من الجمعيات الفيروسية خلال العدوى من الخلايا العصبية الأولية.
Abstract
وقد مكنت التطورات في تقنيات الخلية الحية المجهري مضان، فضلا عن بناء السلالات الفيروسية المؤتلف التي تعبر عن البروتينات الانصهار فلوري التصور في الوقت الحقيقي النقل وانتشار عدوى الفيروس الهربسي الألفائي من الخلايا العصبية. الأداة المساعدة من رواية البروتينات الانصهار الفلورسنت لغشاء الفيروسية، غشاء، وcapsids ألف، بالاشتراك مع التصوير الخلية الحية، حدد جمعيات الجسيمات الفيروسية تمر النقل داخل محاور عصبية. وقد استخدمت أدوات مشابهة بنجاح لتحليل خلية خلية انتشار الجسيمات الفيروسية لتحديد عدد وتنوع virions تنتقل بين الخلايا. الأهم من ذلك أن تقنيات تصوير الخلايا الحية النقل تقدمي وانتشار إنتاج ثروة من المعلومات بما في ذلك السرعات الجسيمات النقل والتوزيع من الجزيئات، والتحليلات الزمنية للتوطين البروتين. جنبا إلى جنب مع التقنيات الوراثية الفيروسية الكلاسيكية، وقد وفرت هذه المنهجيات رؤى الحرجةإلى أسئلة الآلية الهامة. في هذه المادة ونحن تصف بالتفصيل أساليب التصوير التي تم وضعها للإجابة على الأسئلة الأساسية للالهربسي الألفائي نقل الفيروس وانتشاره.
Introduction
إصابة الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) عن طريق الفيروسات الهربسي الألفائي مثل فيروس الهربس البسيط (HSV) -1، -2، وفيروس داء الكلب الكاذب (PRV) ينطوي على عدة خطوات معقدة ودرجة عالية من التنظيم في جميع مراحل الحياة الفيروسية. النقل داخل الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المحيطي أمر بالغ الأهمية خلال أحداث كلا العدوى الفيروسية الأولية واللاحقة انتشار بين المضيف. الآليات الجزيئية التي تعدل عنصرين من دورة الحياة الفيروسية؛ النقل الموجهة من الجمعيات الفيروسية بعيدا عن أجسام الخلايا ضمن محاور عصبية (النقل تقدمي) ونقل لاحقا إلى خلايا virions عرضة (انتشار تقدمي) مهمة لفهم المرضية هربس.
النقل والخروج من الجسيمات الفيروسية في الخلايا العصبية تعتمد على تجميع ناضجة المعدية 1،2 الفيريون. واستخدمت المقايسات ثابت سابقا، بما في ذلك المناعي (IF) والمجهر الإلكتروني (EM)، لدراسة حالة جمعية الجسيمات والبروتوكول الاضافيالتفاعلات عين المرتبطة بالنقل الفيريون وانتشار 3-6. إلا أن الطبيعة الديناميكية لنقل virions والتحف التجريبية التي أدخلتها التثبيت الكيميائية مرتبك تفسير الصور الثابتة 7،8. مؤخرا، قد تم وصفها عدد من البروتينات الانصهار الفيروسي الفلورسنت لفيروس الهربس البسيط وPRV التي لها تأثيرات ضئيلة على وظيفة البروتين. وغالبا ما يقترن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) والبروتينات الفلورية الأحمر (mCherry أو mRFP) fluorophores للسماح التصوير لاثنين من المكونات الهيكلية ثلاثة من الفيريون ناضجة: قفيصة، غشاء، وبروتين سكري 9-11. يعيش التصوير الخلية النقل تقدمي استخدام مزدوج المسمى الفيروسات يتصور الدولة تجميع الجسيمات الفيروسية أثناء النقل. وتستخدم fluorophore مماثلة معربا عن سلالات فيروسية لتصور عدد وتنوع الجينوم الفيروسي بعد انتشار 12،13. خصائص البروتينات الفلورية (مراجعة في 14،15) تؤثر بشكل كبيرالقدرة على تصور جمعيات الفيروسية أو الخلوية. ينبغي النظر في الخصائص الذاتية للبروتين فلوري، بما في ذلك الذات التفاعلات والاستقرار، عند تصميم واختبار اندماج بروتين رواية للحفاظ على النوع البري وظيفة.
بالتزامن مع اندماج بروتين فلوري، وهما جيدا تتميز في أنظمة زراعة الخلايا في المختبر وتستخدم لتصوير الخلايا الحية من عدوى فيروس الهربس: فصل 16 و 17 مجزأة (الشكل 1A) الفئران متفوقة عنق الرحم العقد (SCG) الخلايا العصبية. في كلا النظامين، يتم تشريح الجنينية SCG، وفصلها إلى هيئات خلية واحدة، ومطلي لفي المختبر زراعة 18. الخلايا العصبية SCG هي جزء من الجهاز العصبي اللاإرادي ويمكن تربيتها بسهولة ومتباينة من قبل عامل نمو الخلايا العصبية (NGF) في ناضجة الاستقطاب فيفو السابقين الدولة. الخلايا العصبية SCG فصلها تشكل شبكة ممتدة من المحاور التي يسمح جمعةأو التصور من الجسيمات الفيروسية لأنها تمر بعملية انتقال تقدمي 6. الثقافات SCG مجزأة توفير العزلة فلويديك من جسم الخلية العصبية (S مقصورة) ومصطلحات محوار البعيدة (N مقصورة) 19. وقد تم نشر عدد من بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لبناء واستخدام الخلايا العصبية باستخدام مجزأة الأصلي أو تعديل ل20 Campenot الغرف 17 سابقا. العزلة فلويديك يسمح للعدوى انتقائية من أجسام الخلايا العصبية والكشف عن virions ذرية بعد النقل إلى مصطلحات محوار معزولة. الطلاء الخلايا الظهارية على مصطلحات مسبق للإصابة توفر الخلايا المتلقية لانتشار عدوى فيروسية.
هناك العديد من العناصر الأساسية الهامة لجميع الخلايا الحية التجريب التصوير، ولكن الأكثر ملاءمة لبروتوكولات لدينا هي: اقتناء الآلي صورة، والإضاءة الفلورسنت، وسرعة التصوير والمراقبة البيئية. لجميع تجارب التصوير، ونحن نستخدممقلوب، الآلي، إضاءة المجهر epifluorescence (الشكل 1B). بنيت المجهر حول نيكون الكسوف تي قاعدة، وتوظف عددا من سيطرة النظم الآلية الكمبيوتر بسرعة إعادة تكوين المجهر خلال الحصول على الصور الآلي. لإضاءة مضان، ونحن نستخدم واسعة الطيف الزئبق مصباح القوس التي يمكن أن تكون مخففة مع مرشحات الكثافة محايدة على طول مسار إضاءة. مرشحات الإثارة لحد من الطيف من الإضاءة الفلورسنت وعندما يقترن مع المرايا مزدوج اللون متعددة تمرير والمرشحات الانبعاثات مضان تصور مركبات الفلورسنت محددة. هي التي شنت على مرشحات الإثارة وانبعاث في التحول بسرعة عجلات مستقلة، مرشح لتمكين اكتساب متتابعة السريع للقنوات الفلورسنت مختلفة. ومما يعزز من سرعة الحصول على الصور كذلك مع كاميرا EM-CCD حساسة وسريعة ومفيدة للكشف عن إشارات كثافة منخفضة وقصيرة صورة قراءة مرات. الرقابة البيئية على microscويتحقق مكتب مستشار رئيس الوزراء مع كبار مرحلة ساخنة الحاضنة وسخان عدسة الهدف للحفاظ على العينات عند درجات حرارة مرتفعة في حين يتم تمرير 2 المخصب جو مرطب وأول أكسيد الكربون في الحاضنة. يتم الاحتفاظ المجهر في غرفة مظلمة مع الحفاظ على درجة الحرارة المحيطة يقرب من 25 درجة مئوية، وضوء خارج الحد الأدنى مع ستائر التعتيم على جميع النوافذ. البروتوكولات التالية تصف استخدام هذا النظام لنقل تقدمي وانتشار المقايسات.
وهناك عدد من البدائل موجودة للسيطرة على متغيرات التصوير الخلية الحية. السيطرة على إعدادات المجهري يمكن القيام بها يدويا أو من خلال النظم الآلية تعتمد على البرمجيات الاحتكارية. ويمكن تحقيق إضاءة الهالوجين مع مضان، LED أو مصادر الليزر. يتم تعديل سرعة التصوير من سرعة تبديل فلتر والوقت لتصور إشارة مع نظام الكشف المقترنة. ويمكن تحقيق الرقابة البيئية مع الأجهزة المتخصصة على ميلالمرحلة croscope، الضميمة من كل أو جزء من المجهر في مربع ساخنة ومرطب، أو عن طريق رفع درجة حرارة الغرفة حيث سيتم تنفيذ المجهري. كل من هذه البدائل لديها مزايا وعيوب تتعلق التكلفة والأداء.
في بروتوكول لاحقة، ونحن من التفصيل استخدام التصوير الخلية الحية لدراسة النقل تقدمي السريع وانتشار تقدمي من الفيروسات الهربسي الألفائي من خلال استخدام سلالات فيروسية المؤتلف. في الوقت الحقيقي التصوير الخلية الحية يتصور قفيصة، غشاء، و / أو بروتين سكري شارك في التعريب على الهياكل الحيوية يمر النقل داخل محاور 11. التصوير تيميلابسي بين عشية وضحاها من الثقافات العصبية مجزأة يتصور محور عصبي الخروج الفيريون والعدوى من الخلايا عرضة 12. وقد تم تحسين البروتوكولات المعروضة هنا للاستخدام مع نظام التصوير خاصة لدينا، ولكن يتم عرض بعبارات عامة بالنسبة إلى العناصر الأربعة للتصوير الخلايا الحية. في المناقشة نحنسوف مزيد من التفاصيل بعض من التحسين ما هو ضروري لإجراء التجارب الناجحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من تصوير الخلايا الحية ومراقبة العمليات البيولوجية لأنها تحدث دون تغيير كبير بفعل المراقبة. ويتم تحقيق هذا الهدف عن طريق الاستفادة المثلى ثلاثة متغيرات: مراقبة البيئة، وسرعة التصوير، والإضاءة مضان. يجب أن يكون متوازنا بين هذه المتغيرات التي تعتمد لتحقيق ظروف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمدة LWE وRK من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح R37 NS033506-16 و R01 NS060699-03. كان مدعوما من قبل المجتمع MPT لسرطان زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه الأمريكية (PF-10-057-01-MPC). كانت المشورة والمعرفة من الدكتور ماثيو ليمان والدكتور أورين Kobiler دور أساسي في تصميم التكوين المجهر وأساليب التصوير الخلية الحية. كما نتقدم بالشكر لنيل بارلو وبرايان كين T. من نيكون الأجهزة للمساعدة التقنية في اقتناء وتركيب وأداء المجهر.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad – ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry – ET |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch’ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch’ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
