Стационарная, Pre-стационарная, и односпальная кровать-оборота кинетические измерения активности ДНК гликозилаза

Аэробной среде спешит геномной нестабильности. Основным promutagenic поражение ДНК в результате окислительного стресса 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxoG). Это связано с неоднозначным кодирования потенциал 8-oxoG. Человека 8-оксогуанин ДНК гликозилазу (OGG1) отвечает за разработку базы репарации 8-oxoG. Гликозилазу деятельности OGG1 акцизов 8-oxoG базы в результате ДНК-продукт с сайта апуриновыми (AP-сайта). Слабую активность лиазы OGG1 можно надрезать AP-сайта в некоторых случаях.

Кинетическая характеристика ДНК гликозилазами вообще считает, что они проявляют двухфазный курсах времени. После начальной фазы быстрого образования продукта (т.е. разрыв), линейный стационарной фазы наблюдается ^1-3. Такое поведение является показателем шагом после химии (т.е. конформационных изменений или выпуска продукта), которые лимитирующей при линейной части хода времени, тогда как борй этап, часто упоминается как переходный этап, соответствует образование продукта в активном центре фермента в ходе первого цикла реакции. При выпуске продукта является ограничение скорости во время стационарной фазы, измерения активности обеспечивают качественную меру продукта ДНК-связывающим сродством, но не предоставляют информацию о кинетической событиях в активном центре фермента (например, химия). Таким образом, методы, чтобы изолировать и измерить экспоненциальное предварительно стационарного взрыва фазе необходимо, чтобы исследовать события в течение первых ферментативной оборот в активном ⁴ центре фермента.

Существуют три стандартных кинетические подходы для характеристики каталитического поведение OGG1 (1) стационарный, (2) предварительно стационарный, и (3) одного оборота. Эти подходы отличаются друг от друга на концентрацию фермента в реакционной смеси и фермента к субстрату соотношение используемой в каждом подходе. В типичной стационарный подходиногда называют несколько кинетика оборота, низкие концентрации фермента, используют для последующей образование продукта. Концентрации субстрата значительно превышает концентрацию фермента, так что несколько ферментативных обороты не оказывают существенного влияния концентрации субстрата. В этой ситуации время курсов должны быть линейными и часто бывает трудно определить, является ли взрыв произошел во время первого оборота из-за низкой концентрации фермента, используемого в данном подходе, обратите внимание, что взрыв амплитуды эквивалентно концентрации фермента. Эту проблему можно решить путем использования более высокой концентрации фермента и экстраполяции линейной курс времени нулевого времени для обнаружения ли первый ферментативный оборот произошло быстро. Отрезок на оси ординат (Y-ось) должна быть пропорциональна концентрации фермента и обеспечивает измерение фермент активно взаимодействует с подложкой. Хотя такой подход может, в принципе свидетельствуют о существовании взрыв фазе дифferent подход необходим для измерения кинетики взрыв фазы. Во многих случаях взрыв фаза слишком быстро, чтобы измерить ручного микширования и методы тушения. В этом случае предварительно стационарных и одного оборота кинетической (т.е. переходных кинетической) приближается часто требуется быстрое смешивание и закалки инструмента следовать ранние моменты времени реакции ^5. В предварительно стационарный подход высокие концентрации фермента используются так, что значительное количество продукта образуется во время первого оборота. Поскольку несколько оборотов следуют наблюдать каталитического велосипедные (т.е. линейной фазой, которая следует за разрыв), концентраци субстрата составл ет больше, чем концентрация фермента ([фермент] <[субстрата]). Для выделения событий в активном центре фермента без каталитического езда на велосипеде, одного оборота условиях были использованы. В этом случае подложка пропитана фермента (E >> S) так, чтобы все подложки будет участвовать яN 'одного оборота и, как правило, проявляют одноэкспоненциальный время курса.

Как отмечалось выше, для ферментов, которые демонстрируют взрыв фазе, выпуск продукции (к _{выключен)} часто ограничивает скорость стационарной фазы хода времени. Скорость выпуска продукта (V _SS, конц. / Время) может быть определена из наклона линейной стационарной фазы. Концентрация активного фермента (Е), необходимых для преобразования скорости выпуска продукта на внутренние константы скорости где к _{OFF =} V _SS / [E]. Важно отметить, что концентрация активного фермента обычно ниже, чем измеренные концентрации белка из-за примесей, неактивный фермент, фермент, не продуктивно связаны с подложкой, и метод, используемый для определения концентрации белка. Концентрация активного фермента может быть определена из пакета, когда амплитуда выпуска продукта идет медленно. Таким образом, экстраполяция стационарных время курсанулевое время дает оценку активного фермента, необходимое для расчета K _OFF (выпуска продукции) от наблюдаемых стационарных ставке.

Для измерения кинетики взрыв, предварительно стационарный подход необходимо следовать образование продукта в течение первого оборота, что происходит до линейной стационарной фазы. Взрыв кинетики следует формирование фермента промежуточным продуктом. После Реакцию инициировали путем смешивания фермента с субстратом, количество фермента, продукт резко возрастает, пока реакция не достигает устойчивого фазового состояния. Если катализ происходит намного быстрее, чем выпуск продукта, амплитуда всплеска равна активно участвует фермент и наблюдаемое экспоненциальное приближение к равновесию (к _набл) соответствует скорости химическое превращение субстрата в продукт, при условии, что обратная скорость химии является незначительным.

В некоторых случаях каталитического суцепляются мешает предварительного стационарного анализа, такие как, когда величины ставки по химии и выпуска продукции существенно не отличаются. В этом случае, используя относительный избыток фермента к субстрату предотвращает каталитического на велосипеде и пределы подложки связанный с ферментом в один оборот. Таким образом, первый этап химической реакции может быть выделен и точно определены в качестве первого порядка константы скорости (к _набл). Это константа скорости должна быть похожа на K _набл определяется из предварительного стационарного подхода, описанного выше.

Здесь мы описываем, как эти кинетические подходы могут быть использованы для анализа гликозилаза активность OGG1.