Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Um ambiente aeróbico acelera instabilidade genômica. Uma lesão grande de DNA resultante promutagenic do stress oxidativo é 7,8-di-hidro-8-oxoguanina (8-oxoG). Isto é devido ao potencial de codificação ambígua de 8-oxoG. Human 8 oxoguanine DNA glicosilase (OGG1) é responsável por iniciar reparo por excisão de base do 8 oxoG. A atividade glicosilase de OGG1 extirpa a base de 8 oxoG resultando em DNA produto com um site apurínico (AP-local). A atividade lyase fraco OGG1 pode incisão no AP local em alguns casos.

Caracterização cinética da glicosilases DNA geralmente acha que eles exibem cursos de tempo bifásicos. Depois de uma fase rápida inicial de formação do produto (isto é, explosão), uma fase de estado estacionário linear é observada ^1-3. Este comportamento é indicativo de um passo na sequência da química (isto é, a mudança conformacional ou libertação do produto) a ser limitante da velocidade, durante a porção linear do decurso do tempo, enquanto que a brocaª fase, muitas vezes referida como a fase transitória, corresponde à formação do produto no sítio activo da enzima, durante o primeiro ciclo de reacção. Quando o lançamento do produto é a taxa de limitação durante a fase de steady-state, as medições de atividade fornecer uma medida qualitativa do DNA produto afinidade de ligação, mas não fornecem informações cinética sobre eventos no sítio ativo da enzima (ou seja, química). Deste modo, os métodos para isolar e medir a fase do sincronismo de pré-estado estacionário exponencial são necessários para investigar acontecimentos durante a primeira rotação enzimática em local activo da enzima ^4.

Existem três métodos cinéticos padrão para caracterizar o comportamento catalítico do OGG1, (1) no estado estacionário, (2) pré-de estado estacionário, e (3) um único volume. Estas abordagens diferem umas das outras pela concentração da enzima na mistura de reacção e da enzima em relação ao substrato utilizada em cada abordagem. Em uma abordagem típica de estado estacionário,por vezes referido como o volume de negócios múltiplos cinética, baixas concentrações de enzima são utilizados para seguir a formação do produto. A concentração do substrato é muito superior à concentração de enzima de modo a que várias das modificações enzimáticas não afectam significativamente a concentração de substrato. Nesta situação, os cursos de tempo deve ser linear e muitas vezes é difícil discernir se uma explosão ocorreu durante a primeira rotação, devido à baixa concentração de enzima usada neste método; nota que a amplitude de ruptura é equivalente à concentração de enzima. Isto pode ser ultrapassado utilizando uma concentração de enzima mais elevada e extrapolando o curso de tempo linear para o tempo zero para detectar se o primeiro volume enzimática ocorreu rapidamente. O intercepto no eixo das ordenadas (eixo y) deve ser proporcional à concentração de enzima e fornece uma medida da enzima activa envolvida com o substrato. Embora esta abordagem pode, em princípio fornecem evidência para a existência de uma fase de explosão, uma diferené necessária para medir abordagem rente a cinética da fase de sincronização. Em muitos casos, a fase de explosão é muito rápido de medir por meio de técnicas de mixagem e têmpera manuais. Nesta situação, a cinética de pré-estado estacionário e um único volume de negócios (ou seja cinética transiente) aproxima-se muitas vezes requerem um instrumento de mistura rápida e de têmpera para seguir os pontos de uma reacção de ⁵ tempo iniciais. Em uma abordagem de pré-estado estacionário elevadas concentrações de enzima são utilizadas de modo a que uma quantidade significativa de produto é formado durante a primeira rotação. Dado que várias das modificações são seguidos para observar ciclismo catalítica (isto é, a fase linear que segue a rajada), a concentração de substrato é maior do que a concentração de enzima ([enzima] <[substrato]). Para isolar os eventos no sítio ativo da enzima sem ciclismo catalítico, são utilizadas as condições de um único volume de negócios. Neste caso, o substrato é impregnado com a enzima (E >> S), de modo que todo o substrato vai participar in o «volume de negócios single 'e normalmente apresentam um curso de tempo single-exponencial.

Como mencionado acima para as enzimas que exibem uma fase do sincronismo, de libertação do produto (k _off) muitas vezes limita a taxa da fase de estado estacionário ao longo do tempo. A taxa de libertação de produto (. / Hora v _ss, conc) pode ser determinada a partir do declive da fase de estado estacionário linear. A concentração da enzima ativa (E) é necessário para converter a taxa de liberação do produto para uma constante taxa intrínseca onde k _off = v _ss / [E]. Importante, a concentração de enzima activa é tipicamente menor do que a concentração de proteína medida devido às impurezas, enzima inactiva, enzima não produtivamente ligado ao substrato e ao método utilizado para determinar a concentração de proteína. A concentração de enzima activa pode ser determinado a partir da amplitude de ruptura quando a libertação do produto é lenta. Assim, extrapolando a um curso de tempo de estado estacionário paratempo zero fornece uma estimativa da enzima activa necessária para calcular k _off (libertação do produto) a partir da taxa em estado estacionário observada.

Para medir a cinética da explosão, uma abordagem de pré-estado estacionário é necessário seguir a formação do produto, durante a primeira rotação, que ocorre antes da fase de estado estacionário linear. A cinética de ruptura segue a formação do intermediário enzima-produto. Uma vez que a reacção é iniciada pela enzima de mistura com o substrato, a quantidade do produto da enzima aumenta rapidamente até que a reacção atinge uma fase de estado estacionário. Se a catálise é muito mais rápida do que a libertação do produto, a amplitude do impulso é igual a enzima envolvida activamente e a abordagem exponencial observada até ao equilíbrio _(kobs) corresponde à taxa de conversão química do substrato em produto, assumindo que a taxa de reverso química é negligenciável.

Em alguns casos cy catalíticaagarram interfere com a análise pré-steady-state, como quando as magnitudes de taxas para a química e lançamento do produto não são significativamente diferentes. Neste caso, utilizando o excesso de enzima em relação ao substrato previne ciclismo catalítico e do substrato com a enzima de limites ligado a um único volume. Por conseguinte, o primeiro passo da reacção química pode ser isolado e determinado com precisão como a constante de velocidade de primeira ordem (k _obs). Esta constante de velocidade deve ser semelhante ao _kobs determinada a partir da abordagem de pré-estado estacionário descrito acima.

Aqui descrevemos como estes métodos cinéticos pode ser utilizado para analisar a actividade de OGG1 glicosilase.