Steady-state, Pre-steady-state, en Single-omzet Kinetic Meting voor DNA Glycosylase Activiteit

Een aëroob milieu haast genomische instabiliteit. Een belangrijke promutagene DNA letsel als gevolg van oxidatieve stress is 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dit komt door de dubbelzinnige codering potentieel van 8-oxoG. Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) is verantwoordelijk voor het initiëren base excisie reparatie van 8-oxoG. De glycosylase activiteit van OGG1 snijdt de 8-oxoG base resulteert in product-DNA met een apurinische website (AP-site). Een zwakke lyase activiteit van OGG1 kan de AP-plaats incisie in sommige gevallen.

Kinetische karakterisering van DNA glycosylases wordt algemeen gesteld dat ze vertonen bifasische tijd cursussen. Na een eerste snelle fase van de vorming van product (ie burst), wordt een lineaire steady-state fase waargenomen ^1-3. Dit gedrag is een indicatie van een stap na chemie (dwz vormverandering of release van een product) worden snelheidsbeperkende tijdens het lineaire gedeelte van de tijd natuurlijk, terwijl de boore fase, vaak aangeduid als de aanloopfase overeenkomt met productvorming aan het enzym actieve plaats tijdens de eerste cyclus van de reactie. Wanneer het product release is snelheidsbeperkende tijdens de steady-state fase, activiteit metingen wordt een kwalitatieve maatstaf van product DNA bindingsaffiniteit, maar bieden geen kinetische informatie over gebeurtenissen in het enzym actieve plaats (dwz chemie). Dienovereenkomstig worden methoden om de exponentiële pre-steady-state salvofase isoleren en te meten die nodig is om gebeurtenissen tijdens de eerste enzymatische omzet aan het enzym actieve plaats ⁴ sonde.

Er zijn drie standaard kinetische benaderingen van de katalytische gedrag van OGG1 karakteriseren, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, en (3) single-omzet. Deze benaderingen verschillen van elkaar door de enzymconcentratie in het reactiemengsel en de enzym substraat verhouding gebruikt in elke benadering. In een typisch steady-state benadering,soms aangeduid als meerdere omzet kinetiek, zijn lage concentraties enzym om de vorming te volgen. Het substraat concentratie veel groter is dan het enzym concentratie zodat meerdere enzymatische omzet hebben geen significante invloed substraat concentratie. In deze situatie dient een cursus lineair zijn en het is vaak moeilijk om te onderscheiden of een burst tijdens de eerste omzet door de lage concentratie enzym in deze benadering, Burst-amplitude is gelijk aan de enzymconcentratie. Dit kan worden ondervangen door een hogere enzymconcentratie en lineaire extrapolatie van de tijdsduur tot nul tijd te detecteren of de eerste enzymatische omzet zich snel. Het snijpunt langs de ordinaat (y-as) moet evenredig met de enzymconcentratie zijn en verschaft een maat voor het actief enzym met substraat. Hoewel deze benadering kan in beginsel bewijs voor het bestaan ​​van een burst fase een diflende benadering vereist de kinetica van de salvofase meten. In veel gevallen de salvofase te snel te meten door handmatige vermenging en afschrikken technieken. In deze situatie, pre-steady-state en single-omzet kinetische (dwz transiënte kinetische) zal vaak een snel mengen en afschrikken instrument vroege tijdstippen van reactie ⁵ volgen. In een pre-steady-state benadering hoge concentraties enzym worden gebruikt, zodat een aanzienlijke hoeveelheid product wordt gevormd tijdens de eerste omzet. Aangezien meerdere omzet gevolgd voor katalytische fietsen (de lineaire fase die de volgende burst) observeren substraatconcentratie hoger is dan de enzymconcentratie ([enzyme] <[substraat]). Om gebeurtenissen te isoleren op de actieve plaats van het enzym zonder katalysator fietsen, zijn single-omzet condities benut. In dit geval is verzadigd met substraat-enzym (E >> S) zodat al het substraat i deelnemenn de 'single omzet' en zal vertonen typisch een enkel-exponentiële tijdsverloop.

Zoals hierboven is opgemerkt voor enzymen die een uitbarsting fase, product release (k _off) vertonen vaak beperkt de snelheid van de steady-state fase van het tijdsverloop. De snelheid van product afgifte (v _ss, conc. / Tijd) kan worden bepaald uit de helling van de lineaire steady-state fase. De actieve enzymconcentratie (E) is nodig om de snelheid van product afgifte converteren een intrinsieke snelheidsconstante waarbij _koff = v _ss / [E]. Belangrijk is dat de actieve enzymconcentratie doorgaans lager is dan de eiwitconcentratie gemeten door verontreinigingen, inactieve enzym, niet-productief gebonden aan substraat, en de methode voor eiwitconcentratie te bepalen. De actieve enzymconcentratie kan worden bepaald uit de burst amplitude als product release traag. Zo extrapoleren een steady-state tijdsverloop aanzero tijd geeft een schatting van actief enzym nodig om te berekenen k _off (product release) van de waargenomen steady-state rate.

Om de kinetiek van de burst te meten, een pre-steady-state benadering is noodzakelijk om de vorming product volgen gedurende de eerste omzet die optreedt voorafgaand aan de lineaire steady-state fase. De burst kinetiek volgt de vorming van enzym-intermediair product. Nadat de reactie wordt gestart door het mengen van enzym met substraat, de hoeveelheid enzym-product snel toe totdat het reactiemengsel een stationaire fase bereikt. Als katalyse veel sneller dan product release, de amplitude van de burst gelijk is aan actief enzym en de waargenomen exponentiële benadering van evenwicht (k _obs) overeenkomt met de snelheid van chemische omzetting waarmee het substraat in product, ervan uitgaande dat de snelheid van omgekeerde chemie is verwaarloosbaar.

In sommige gevallen katalytische cyvastklampen interfereert met een pre-steady-state-analyse, zoals wanneer de grootheden van de tarieven voor de chemie en de release van een product zijn niet significant verschillend. In dit geval, gebruik overmaat enzym ten opzichte van substraat voorkomt katalytische fietsen en beperkingen substraat gebonden enzym met een enkele omzet. Dienovereenkomstig kan de eerste chemische reactiestap als de eerste-orde snelheidsconstante (k _obs) worden geïsoleerd en nauwkeurig bepaald. Dit percentage moet constant zijn vergelijkbaar met k _obs bepaald uit de pre-steady-state benadering hierboven beschreven.

Hier beschrijven we hoe deze kinetische benaderingen kunnen worden gebruikt om de glycosylase activiteit van OGG1 analyseren.