L'état d'équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d'affaires de l'activité de ADNglycosylase

Un milieu aérobie accélère l'instabilité génomique. Une importante lésion de l'ADN promutagène résultant du stress oxydatif est la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG). Cela est dû au potentiel de codage ambigu de 8 oxoG. Human 8 oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) est chargé d'initier la réparation par excision de base de 8 oxoG. L'activité glycosylase de OGG1 excise la base de 8 oxoG résultant dans l'ADN de produit avec un site apurinique (AP-site). Une activité de lyase faible de OGG1 peut inciser le site de AP dans certains cas.

Caractérisation cinétique des ADN glycosylases trouve généralement qu'ils présentent des cours à temps biphasique. Après une phase initiale rapide de la formation du produit (c.-à-burst), une phase de régime permanent linéaire est observée ^3.1. Ce comportement est révélateur d'une étape à la suite chimie (ie changement de conformation ou la libération du produit) étant de limitation de vitesse au cours de la partie linéaire de l'évolution dans le temps, alors que la fraiseère phase, souvent désigné comme la phase transitoire, correspond à la formation du produit sur le site actif de l'enzyme au cours du premier cycle de la réaction. Lorsque la libération du produit est la limitation du débit au cours de la phase stationnaire, mesures d'activité fournissent une mesure qualitative du produit ADN affinité de liaison, mais ne fournissent pas d'informations concernant la cinétique des événements sur le site actif de l'enzyme (c.-à-chimie). En conséquence, les méthodes d'isoler et de mesurer la phase de la salve de pré-état stationnaire exponentielle sont nécessaires pour sonder événements au cours de la première rotation enzymatique au niveau du site actif ⁴ de l'enzyme.

Il existe trois approches cinétiques classiques pour caractériser le comportement catalytique de OGG1, (1) l'état d'équilibre, (2) pré-état stationnaire, et (3) un seul chiffre d'affaires. Ces approches se distinguent les unes des autres par la concentration d'enzyme dans le milieu réactionnel et le rapport enzyme à substrat utilisé dans chaque approche. Dans une approche typique d'équilibre,parfois appelé plusieurs cinétique de rotation, de faibles concentrations d'enzyme sont utilisés pour suivre la formation du produit. La concentration du substrat dépasse largement la concentration de l'enzyme de sorte que plusieurs revirements enzymatiques n'affectent pas significativement la concentration du substrat. Dans cette situation, les temps devraient être linéaire et il est souvent difficile de discerner si une explosion a eu lieu au cours du premier chiffre d'affaires en raison de la faible concentration d'enzyme utilisée dans cette approche; noter que l'amplitude de la rafale est équivalente à la concentration de l'enzyme. Cela peut être surmonté en utilisant une concentration de l'enzyme supérieur et en extrapolant l'évolution temporelle linéaire au temps zéro pour détecter si le premier chiffre d'affaires s'est rapidement enzymatique. L'interception sur l'axe des ordonnées (axe des y) doit être proportionnelle à la concentration de l'enzyme et fournit une mesure de l'enzyme activement engagé avec le substrat. Bien que cette approche ne peut en principe fournir des preuves de l'existence d'une phase de la salve, une difrents approche est nécessaire pour mesurer la cinétique de la phase de la salve. Dans de nombreux cas, la phase d'éclatement est trop rapide pour mesurer par des techniques de mélange et d'extinction manuelles. Dans cette situation, cinétique pré-état stable et unique chiffre d'affaires (c.-à-cinétique transitoire) approches nécessitent souvent un instrument de mélange rapide et la trempe de suivre les points de temps au début d'une réaction ^5. Dans une approche pré-état d'équilibre des concentrations élevées d'enzyme sont utilisés de telle sorte qu'une quantité importante de produit est formé au cours de la première rotation. Depuis plusieurs revirements sont suivis pour observer cyclisme catalytique (ie la phase linéaire qui suit l'éclatement), la concentration en substrat est supérieure à la concentration de l'enzyme ([enzyme] <[substrat]). Pour isoler des événements sur le site actif de l'enzyme sans vélo catalytique, conditions unique chiffre d'affaires sont utilisés. Dans ce cas, le substrat est saturé avec l'enzyme (E S >>) de telle sorte que la totalité du substrat participeront in le 'chiffre d'affaires unique »et présenteront typiquement un cours à temps simple exponentielle.

Comme indiqué ci-dessus pour les enzymes qui présentent une phase d'éclatement, la libération du produit (k _off) limite souvent le taux de la phase stationnaire de l'évolution dans le temps. Le taux de libération du produit (. / Heure V _SS, conc) peut être déterminée à partir de la pente de la phase stationnaire linéaire. La concentration d'enzyme active (E) est nécessaire pour convertir le taux de libération du produit à un rythme intrinsèque constante k _off = v _ss / [E]. Fait important, la concentration de l'enzyme active est généralement inférieure à la concentration mesurée en protéines due aux impuretés, enzyme inactive, enzyme non-productive liés au substrat, et la méthode utilisée pour déterminer la concentration en protéines. La concentration de l'enzyme active puisse être déterminée à partir de l'amplitude de salve lorsque la libération du produit est lente. Ainsi, en extrapolant à un cours à temps l'état d'équilibre àtemps zéro fournit une estimation de l'enzyme active nécessaire pour calculer k _off (sortie du produit) du taux d'équilibre observé.

Pour mesurer la cinétique de l'explosion, une approche pré-état d'équilibre est nécessaire de suivre la formation du produit au cours du premier chiffre d'affaires qui se produit avant la phase stationnaire linéaire. La cinétique d'éclatement suit la formation de l'enzyme produit intermédiaire. Une fois que la réaction est initiée par l'enzyme de mélange avec le substrat, la quantité de l'enzyme produit augmente rapidement jusqu'à ce que la réaction atteigne une phase de régime permanent. Si la catalyse est beaucoup plus rapide que la libération du produit, l'amplitude de la rafale est égale à enzyme engagé activement et de l'approche exponentielle observée à l'équilibre (k _obs) correspond à la vitesse de conversion chimique du substrat en produit, en supposant que la vitesse inverse de chimie est négligeable.

Dans certains cas, cy catalytiques'accrocher interfère avec une analyse pré-état stationnaire, comme lorsque l'ampleur des taux de la chimie et de la libération du produit ne sont pas significativement différentes. Dans ce cas, employant excès relatif de l'enzyme de substrat empêche les cycles catalytiques et les limites substrat lié avec l'enzyme pour un chiffre d'affaires unique. Par conséquent, la première étape chimique de la réaction peut être isolé et déterminé avec précision que la constante de vitesse de premier ordre (k _obs). Cette constante de vitesse devrait être similaire à _kobs déterminée à partir de l'approche pré-état stationnaire décrit ci-dessus.

Ici, nous décrivons comment ces approches cinétiques peuvent être utilisés pour analyser l'activité glycosylase de OGG1.