ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase
Summary
الدورات الزمنية لنشاط glycosylase من 8 oxoguanine glycosylase DNA هي ثنائي الطور واظهار وابلا من تشكيل المنتج ومرحلة ثابتة للدولة الخطية. استخدام تقنيات تدفق إخماد، وانفجر ويمكن قياس معدلات ثابتة للدولة، والتي تتوافق مع استئصال 8 oxoguanine والإفراج عن glycosylase من الحمض النووي المنتج، على التوالي.
Abstract
الإنسان 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) المكوس والتشوهات الخلقية التأكسدي الآفة DNA 8 أوكسو-7 ،8-dihydroguanine (8 oxoG) من الحمض النووي. ويجري توصيف الحركية للOGG1 لقياس معدلات الختان 8 oxoG والافراج عن المنتج. عندما يكون تركيز OGG1 أقل من الحمض النووي الركيزة، ملاعب وقت تكوين المنتج هي ثنائي الطور؛ ويعقب مرحلة الأسي السريع (أي انفجار) من تشكيل المنتج من قبل مرحلة ثابتة للدولة الخطية. انفجار الأولي من تشكيل المنتج يتوافق مع تركيز الإنزيم تعمل بشكل صحيح على الركيزة، والسعة انفجار يعتمد على تركيز الانزيم. معدل من الدرجة الأولى المستمر للانفجار يتوافق مع معدل لا يتجزأ من الختان 8 oxoG ويقيس معدل ثابت للدولة أبطأ معدل إصدار المنتج (منتج DNA معدل التفكك المستمر، ك إيقاف). هنا، نحن تصف نهج ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، ودوران واحد لعزل وقياس SPخطوات ecific خلال OGG1 الدراجات الحفاز. ويستخدم الفلورسنت المسمى قليل النوكليوتيد المحتوية على الآفة وOGG1 تنقيته لتسهيل القياسات الحركية الدقيقة. حيث يتم استخدام تركيزات منخفضة انزيم لإجراء قياسات ثابتة للدولة، ودليل خلط الكواشف والتبريد من رد الفعل لا يمكن أن يؤديها للتأكد من معدل ثابت للدولة (ك إيقاف). بالإضافة إلى ذلك، استقراء معدل ثابت للدولة إلى نقطة على الإحداثي في وقت الصفر يشير إلى أن وابلا من تشكيل المنتج وقعت خلال دوران الأول (أي التقاطع y موجبة). معدل ثابت من الدرجة الأولى من مرحلة انفجار الأسي يمكن قياسها باستخدام تقنية الخلط والتبريد السريع الذي يتناول كمية المنتج شكلت في فترات زمنية قصيرة (<1 ثانية) قبل مرحلة ثابتة للدولة ويتوافق مع معدل 8 -oxoG الختان (أي الكيمياء). ويمكن أيضا أن الخطوة الكيميائية يمكن قياسها باستخدام نهج دوران واحد حيث ركوب الدراجات الحفاز هوالوقاية منها عن طريق الحمض النووي تشبع الركيزة مع انزيم (E> S). ويمكن لهذه المناهج قياس الثوابت معدل الابتدائية التي تؤثر على كفاءة إزالة آفة الحمض النووي.
Introduction
بيئة الهوائية يعجل عدم الاستقرار الجيني. A الآفة DNA promutagenic رئيسية ناجمة عن الإجهاد التأكسدي هو 7،8-ثنائي هيدرو-8-oxoguanine (8 oxoG). ويرجع ذلك إلى إمكانية الترميز غامضة من 8 oxoG هذا. الإنسان 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) هي المسؤولة عن الشروع في قاعدة إصلاح الختان من 8 oxoG. النشاط glycosylase من OGG1 المكوس قاعدة 8 oxoG الناتجة في الحمض النووي المنتج مع موقع منزوع البورين (AP-موقع). A النشاط ياز ضعف OGG1 يمكن شق الموقع AP في بعض الحالات.
توصيف الحركية للglycosylases الحمض النووي يرى عموما أن هم يعرضون دورات الوقت ثنائي الطور. بعد مرحلة سريع الأولي من تشكيل المنتج (أي انفجار)، ويلاحظ مرحلة ثابتة للدولة خطي 1-3. هذا السلوك يدل على الخطوة التالية الكيمياء (أي تغيير متعلق بتكوين جزئي أو إطلاق المنتج) يجري معدل منظم أثناء جزء خطية من دورة الزمن، في حين أن برسانت المرحلة، غالبا ما يشار الى مرحلة عابرة، يتوافق مع تشكيل المنتج في موقع نشط انزيم خلال الدورة الأولى من رد الفعل. عندما إطلاق المنتج هو معدل الحد خلال مرحلة ثابتة للدولة، توفير قياسات النشاط مقياس النوعية من الناتج الحمض النووي تقارب ملزمة، ولكنها لا توفر المعلومات الحركية بشأن الأحداث في موقع نشط انزيم (أي الكيمياء). وفقا لذلك، هناك حاجة إلى أساليب لعزل وقياس مرحلة ما قبل انفجار ثابت للدولة الأسي للتحقيق في الأحداث خلال أول دوران الأنزيمية في موقع نشط 4 الإنزيم.
هناك ثلاثة مناهج الحركية القياسية لتوصيف السلوك الحفاز OGG1، (1) الحالة المستقرة، (2) ما قبل ثابت للدولة، و (3) واحد دوران. هذه الأساليب تختلف عن بعضها البعض من تركيز الانزيم في خليط التفاعل والإنزيم إلى نسبة الركيزة المستخدمة في كل نهج. في نهج ثابت للدولة نموذجية،يشار إليها أحيانا باسم حركية دوران متعددة، وتستخدم التركيزات المنخفضة من الانزيم لمتابعة تشكيل المنتج. تركيز الركيزة يتجاوز كثيرا من تركيز الانزيم بحيث تحولات متعددة الأنزيمية لا تؤثر بشكل ملحوظ تركيز الركيزة. في هذه الحالة، ينبغي أن تكون دورات الزمن الخطي وغالبا ما يكون من الصعب تمييز ما إذا كان انفجار وقع أثناء دوران الأول بسبب تركيز انزيم منخفضة تستخدم في هذا النهج، علما أن السعة انفجر ما يعادل تركيز الانزيم. ويمكن التغلب على هذا باستخدام تركيز انزيم العالي واستقراء مسار الزمن الخطي إلى وقت الصفر للكشف عن ما إذا كان أول دوران الأنزيمية حدث بسرعة. التقاطع على الإحداثي (المحور الصادي) وينبغي أن يكون متناسبا مع تركيز الانزيم ويوفر قدرا من الانزيم تشارك بنشاط مع الركيزة. ورغم أن هذا النهج يمكن من حيث المبدأ تقديم أدلة على وجود مرحلة الاندفاع، وDIFمطلوب نهج مختلفتين لقياس حركية مرحلة الانفجار. في كثير من الحالات في المرحلة انفجار سريع جدا لقياس بواسطة تقنيات المزج والتبريد اليدوي. في هذه الحالة، ما قبل الحركية ثابت للدولة ودوران واحد (أي الحركية عابرة) تقترب غالبا ما تتطلب أداة سريعة لخلط والتبريد لمتابعة نقاط وقت مبكر من رد فعل 5. في نهج ما قبل ثابت للدولة وتستخدم تركيزات عالية من انزيم بحيث كمية كبيرة من المنتج وشكلت أثناء دوران الأول. منذ يتم اتباع تحولات متعددة لمراقبة الدراجات الحفاز (أي المرحلة الخطي الذي يلي انفجار)، وتركيز الركيزة أكبر من تركيز انزيم ([إنزيم] <[الركيزة]). لعزل الأحداث في موقع نشط من الانزيم دون ركوب الدراجات الحفاز، وتستخدم ظروف دوران واحد. في هذه الحالة، غير المشبعة الركيزة مع انزيم (E >> S) حتى يتسنى لجميع من الركيزة ستشارك أنان 'دوران واحد' وسوف تظهر عادة بطبيعة الحال الوقت الأسي واحد.
وكما لوحظ أعلاه للحصول على الانزيمات التي تظهر في مرحلة الاندفاع، إصدار المنتج (ك إيقاف) كثيرا ما يحد من معدل المرحلة الحالة المستقرة للدوام. معدل إصدار المنتج (. الوقت / V SS، اضرب) يمكن تحديد من المنحدر من مرحلة ثابتة للدولة الخطية. هناك حاجة إلى تركيز الانزيم النشط (E) لتحويل نسبة من الافراج عن المنتج إلى معدل الجوهرية ثابتة حيث k = V قبالة SS / [E]. الأهم من ذلك أن تركيز الانزيم النشط هو أقل عادة من تركيز قياس البروتين بسبب الشوائب، إنزيم غير نشط، إنزيم ملزمة غير منتجة إلى الركيزة، والطريقة المستخدمة لتحديد تركيز البروتين. يمكن تحديد تركيز انزيم بالموقع من السعة انفجار عند إطلاق المنتج هو بطيء. وبالتالي، استقراء مسار وقت ثابت للدولة إلىالساعة الصفر تقديرا من انزيم نشط اللازمة لحساب ك قبالة (إصدار المنتج) من معدل ثابت للدولة المرصودة.
لقياس حركية انفجر، نهج ما قبل ثابت للدولة ضروري لمتابعة تشكيل المنتج أثناء دوران الأولى التي يحدث قبل مرحلة ثابتة للدولة الخطية. حركية انفجار يلي تشكيل انزيم منتج وسيط. مرة واحدة يبدأ رد الفعل عن طريق خلط الانزيم مع الركيزة، وكمية من الإنزيم المنتج بشكل سريع حتى يصل إلى مرحلة رد الفعل حالة مستقرة. إذا الحفز هو أكثر من ذلك بكثير السريع من إصدار المنتج، واتساع انفجار تساوي الانزيم تشارك بنشاط والنهج الأسي المرصودة للتوازن (K OBS) يتوافق مع معدل التحويل الكيميائي للالركيزة للمنتج، على افتراض أن معدل العكسي لل كيمياء لا يكاد يذكر.
في بعض الحالات قبرصي الحفازتتشبث يتداخل مع تحليل ما قبل ثابت للدولة، مثل عندما مقادير من معدلات للكيمياء وإطلاق المنتج ليست مختلفة بشكل كبير. في هذه الحالة، وتوظيف فائض نسبي انزيم إلى الركيزة يمنع ركوب الدراجات الحفاز وحدود الركيزة ملزمة مع الانزيم لدوران واحد. وفقا لذلك، فإن الخطوة الأولى الكيميائية من رد فعل يمكن أن تكون معزولة وتحديدها بدقة وثابت معدل من الدرجة الأولى (K OBS). هذا معدل ثابت يجب ان يكون مماثلا لK OBS تحديد من قبل نهج ثابت للدولة المذكورة أعلاه.
نحن هنا وصف كيف يمكن لهذه المناهج الحركية يمكن استخدامها لتحليل النشاط glycosylase من OGG1.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج الحركية وصفها هنا الخطوط العريضة طرق لتعريف الثوابت الحركية الابتدائية. إذا كان الحال وقت تشكيل المنتج هو ثنائي الطور مع أول دوران الأنزيمية التي تحدث بسرعة، ثم خطوة بعد الكيمياء هو معدل منظم خلال تحولات الحفاز لاحقة. في حالة OGG1، ودوران الأول يمكن قياسها باستخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة جولي K. هورتون لقراءة نقدية للمخطوطة والدكتور راجندرا براساد للحصول على اقتراحات مفيدة والمناقشات. ونشرت أجزاء من هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية، ساسا A وآخرون. آل.، "DNA تسلسل تأثيرات السياق على آخر Glycosylase من الإنسان Glycosylase DNA 8 Oxoguanine." J بيول كيم 287، 36702-36710 (2012) 2. وأيد هذا العمل، كليا أو جزئيا، من قبل المعاهد الوطنية للبحوث الصحية مشروع المنح Z01-ES050158 في برنامج بحوث جماعية، معهد علوم الصحة البيئية.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
