Un protocolo se describe que utiliza ensayos Infinium de Illumina para llevar a cabo la genotipificación a gran escala. Estos ensayos pueden determinar el genotipo de forma fiable a millones de SNPs a través de cientos de muestras de ADN individuales en tres días. Una vez generada, estos genotipos se pueden utilizar para comprobar las asociaciones con una variedad de diferentes enfermedades o fenotipos.
Variantes de genotipado en el genoma humano ha demostrado ser un método eficaz para identificar asociaciones genéticas con fenotipos. La distribución de las variantes dentro de las familias o de las poblaciones puede facilitar la identificación de los factores genéticos de la enfermedad. Panel de Illumina de BeadChips genotipado permite a los investigadores determinar el genotipo de miles o millones de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o para analizar otras variantes genómicas, como el número de copias, a través de un gran número de muestras de ADN. Estos SNPs se pueden propagar por todo el genoma o dirigidos en regiones específicas con el fin de maximizar el potencial descubrimiento. La prueba Infinium ha sido optimizado para producir alta calidad, resultados precisos de forma rápida. Con una configuración adecuada, un solo técnico puede procesar desde unos pocos cientos a más de mil muestras de ADN por semana, dependiendo del tipo de matriz. Este ensayo guía a los usuarios a través de cada paso, empezando con ADN genómico y terminando con el escaneo de la matriz. Usando Reage decoronts, las muestras se amplifican, fragmentada, se precipitó, se resuspendió, se hibrida con el chip, prorrogado por una sola base, manchado, y escaneado a cada una de alta resolución del sistema óptico de imagen iScan o Hi Scan. Se requiere un paso durante la noche para amplificar el ADN. El ADN se desnaturaliza y isotérmicamente amplificado por amplificación de todo el genoma, por lo tanto, no se requiere la PCR. Las muestras se hibridan con las matrices durante una segunda etapa durante la noche. Por el tercer día, las muestras están listas para ser escaneado y analizado. El ADN amplificado puede ser almacenada en grandes cantidades, lo que permite matrices de perlas que se procesen todos los días de la semana, maximizando así el rendimiento.
Escribiendo polimorfismos de nucleótido único (SNP) es un método clave para la identificación de variantes de riesgo asociados con la enfermedad. Históricamente, el alcance de experimentos de genotipado ha sido limitada por la tecnología disponible. Métodos de genotipificación basados en la electroforesis en gel se limitan en la muestra-y SNP-producción [1]. El desarrollo de estos ensayos a menudo puede ser de trabajo intensivo, basándose en la composición y la estructura de la región que rodea la variante para la optimización de [1]. Genotipificación TaqMan, desarrollado por Life Technologies, se puede ejecutar un gran número de muestras de forma rápida y con una mínima participación técnico [2], pero las restricciones SNP-multiplexación siguen limitando el número total de los genotipos a bastante menos de un millón al día [3,4 ]. Plataforma de Sequenom IPLEX también puede ejecutar muchas muestras a la vez, pero, ya que menos de un centenar de SNPs pueden ser multiplexados juntos, el rendimiento es comparativamente bajo en general [5]. Secuencia tecnología SNP de Beckman Coulterpodría producir teóricamente más de tres millones de genotipos por día, pero este rango de proyecto límites de la tecnología a un máximo de sólo cuarenta y ocho SNPs por reacción de [4,6]. Si bien el ensayo GoldenGate puede procesar casi doscientos muestras de ADN de cada día en cientos o miles de SNPs por muestra, el precio por el genotipo no es competitivo con, técnicas de ultra-alto rendimiento avanzados al escribir más de tres mil SNPs a la vez [4,7 ]. Para procesar varios millones de genotipos por día, la escala necesaria para grandes estudios de asociación de todo el genoma, los ensayos de matriz de hibridación se han convertido en la opción más rentable en el mercado.
Línea de Affymetrix arrays de hibridación y de la línea de arrays basados en Infinium de Illumina permiten potencialmente cientos de muestras que se escriben en los cientos de miles o millones de SNPs en paralelo [4,8]. Estos SNPs pueden estar dispersos por todo el genoma, localizada en las regiones de interés, como el exomes, o personalizado a la preferencia del usuario. Estas matrices tienen la ventaja de no sólo ser capaz de determinar el genotipo de forma precisa un millón de SNPs por muestra a la vez, sino también para medir el número de copias variación, anomalías cromosómicas potencialmente revelando. Alineados Infinium matrices OMNI BeadChip actualmente tienen la capacidad de determinar el genotipo de hasta casi cinco millones de marcadores por muestra, incluyendo medio de un millón de loci de encargo, en un máximo de casi un centenar de muestras de cada día.
Como la mayoría de las enfermedades tienen un componente genético, estos experimentos a gran escala puede ser crucial en la búsqueda de genes asociados con la enfermedad. Genotipado de alto rendimiento permite una generación genotipo eficiente de ejemplo establece lo suficientemente grande para detectar de manera convincente de asociación genética en las frecuencias de alelos menores inferiores. Proyectos de genotipado de todo el genoma se pueden utilizar para localizar regiones con estadísticamente significativa frecuencia de los alelos de casos y controles o las diferencias de número de copias [9,10,11]. Según el Ge humano NacionalInstituto de Investigación nome, estudios de asociación del genoma llevó a 1.490 publicaciones separadas entre el 25 de noviembre de 2008 y 25 de enero 2013, derivada del descubrimiento de 8283 SNPs con un p-valor inferior a 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Estos estudios, que investigan las condiciones que van desde la altura con el cáncer testicular, se benefició de las líneas generales que ofrece un análisis de todo el genoma. En casos como estos, regiones enteras de interés podrían haber escapado a la atención había el alcance de la tipificación sido demasiado restrictivo. Por lo tanto, para los análisis de asociación a gran escala, una técnica de determinación del genotipo de todo el genoma es la técnica de elección.
Existen diferentes versiones del ensayo Infinium, cada uno diseñado para ser utilizado con los tipos específicos de arrays. El ensayo InfiniumUltra, discutido en profundidad más adelante, es apropiada para muchos 12 – o 24-muestra fichas de matriz. Estos a menudo genotipo más de cien mil SNPs por muestra de ADN y se centran en tregiones argeted, como en los paneles exoma o personalizados. Otras versiones de ensayo podrían ser necesarias para otros tipos de chips, tales como las matrices de genotipado de todo el genoma. Sin embargo, como todos los ensayos Infinium comparten una base común y difieren principalmente sólo por los nombres de reactivos, los volúmenes de reactivos, o el procedimiento exacto reactivo de tinción, técnicas perfeccionadas en una versión de ensayo a menudo pueden ser de aplicación universal. Otras matrices, tales como arrays de metilación, pueden utilizar un protocolo casi idéntico, también. Se debe tener cuidado al usar sólo la versión del ensayo requerida para el tipo de chip en uso. Algunos tipos, como aquellos que miden el nivel de expresión de genes, podrían requerir el uso de un protocolo nonInfinium.
Las muestras deben ser procesadas en lotes. Por ejemplo, con el ensayo InfiniumUltra, tubos de reactivo de prehibridación contienen suficiente volumen para funcionar 96 muestras, y los tubos no se pueden volver a congelar. Por lo tanto, las muestras se deben ejecutar en lotes de 96 muestras a la vez. Las muestras se amplifican en los abetost días. Después de aproximadamente 1 hora de benchwork, las muestras deben ser calentados en un horno de convección durante 20-24 h. Al día siguiente, casi 4 horas se gastará fragmentación, lo que precipitó y resuspender las muestras, momento en el que las muestras pueden o bien ser congelados para uso futuro o hibrida con el chip. Cargando fichas toma cerca de 2 horas, después de lo cual las muestras se hibridó durante la noche de 16 a 24 h. En el tercer día, la etapa de tinción y la extensión toma ~ 4 horas. Una hora más se gastará de lavado, recubrimiento, y el secado de las virutas. Finalmente, las matrices se escanean, que puede tardar 15-60 min / viruta, dependiendo del tipo utilizado.
Se aplican las medidas de seguridad de laboratorio y de limpieza estándar. Aunque la amplificación está basada en la PCR no es así, las estaciones de trabajo separadas para pre y postamplification procedimientos son necesarios con el fin de reducir al mínimo la probabilidad de contaminación. El número de identificación de cada reactivo kit suministrado en uso hay que estar inscrito en una hoja de seguimiento. Reagents deben descongelarse inmediatamente antes de su uso y de invertir varias veces antes de la dispensación. El ADN que ser escrito debe ser ADN genómico de alta calidad (260/280 relación de absorbancia de 1,6-2,0, 260/230 relación de absorbancia de por debajo de 3,0), aislado por métodos estándar y se cuantifica con un fluorómetro. La degradación de ADN es a menudo un factor que contribuye a los resultados del ensayo de baja calidad. Típicamente, se requiere 200 ng de ADN, aunque esta cantidad puede variar para algunos tipos de chips. Un robot de manejo de líquidos Tecan puede automatizar muchas de las etapas del protocolo y minimizar el error humano como factor.
Aplicaciones de genotipado a gran escala se han utilizado para comprender mejor el mecanismo genético subyacente en muchas enfermedades humanas. El descubrimiento de cualquier variante significativa a través de un análisis de asociación amplia del genoma puede destacar una región candidata para el estudio adicional. Además, los datos genotipo es una buena herramienta para el control de calidad en los proyectos de secuenciación.
Para maximizar el rendimiento de la muestra, múltiples placas de muestra se pueden amplificar y almacenados en sus estados fragmentados, resuspendido. Ocho placas pueden ser amplificados en un solo día, la combinación de las primeras 24 h del protocolo para varios lotes y proporcionar material suficiente para ~ 2-8 días de procesamiento de chip. Si las placas amplificados se almacenan de antemano, y si las nuevas muestras se hibridan a los chips inmediatamente después de la exploración comienza en la ejecución anterior, el procesamiento puede funcionar continuamente sin la necesidad de hacer una pausa para la preparación de la muestra adicional. Por lo tanto, aunque las muestras tendrán tres días para someterse a la completaensayo, los datos se pueden generar todos los días. Fichas Assuming24 se procesan cada día, una semana laboral de 5 días permite más de un 1.000 muestras de ADN para que se ejecuten en un chip de talón 12 muestras. Si cualquier paso o reactivo no ha logrado, sin embargo, varios lotes podrían estar en riesgo de malos resultados antes de cualquier corrección se puede aplicar. Los errores pueden pasar desapercibidos hasta que los arrays se escanean o analizados, por lo tanto, si el rendimiento se maximiza, cientos de muestras en diferentes etapas del protocolo pueden ya han recibido el mismo tratamiento defectuoso sobre el descubrimiento. Como reactivos y la pérdida de datos no se pueden recuperar, el usuario debe sopesar estos riesgos contra la necesidad de un flujo de trabajo acelerado.
El software de análisis de GenomeStudio es la primera oportunidad de medir realmente el éxito del proceso de determinación del genotipo. Si la norma-R vs parcelas intensidad Norma-Theta están debidamente agrupados, la tasa media de las llamadas (por ciento del total de SNPs escrito correctamente) de las muestras debe acercarse a 99%, aunque este valor varía slightly dependiendo del tipo de matriz. Los datos de cualquier muestra con una tarifa de llamadas inferiores a 85-90%, no es digno de confianza y deben desecharse. A efectos de control de calidad, los resultados deben ser comparados con ningún genotipos siempre que sea posible previamente conocidos. Si no existe tal información, intencional duplicación de la muestra es una herramienta útil en la verificación de la placa o de matriz colocaciones. Estos pares de duplicados se deben colocar en chips separados, placas, lotes o proyectos; sus genotipos comprueban tras generación. Si bien las limitaciones de CC específicos varían de acuerdo a la preferencia del investigador, las limitaciones SNP comunes se basan en el éxito llamada de ejemplo, Hardy-Weinberg o missingness entre casos y controles, mientras que las restricciones de muestra comunes se basan en las tarifas de llamadas, incoherencias mendelianos, o las referencias cruzadas del cromosoma X heterocigosidad a los datos clínicos de género [13].
Si surge algún problema, el Dashboard controles, que se encuentra en la sala de análisis, puede ser sometido a laempresa con el fin de determinar la causa. Estos controles a menudo pueden reducir la cuestión a la etapa más probable o el fracaso de reactivos. Si alguno de los SNPs de interés se encuentran a través de un experimento de genotipado Infinium, sus parcelas intensidad debe ser una doble comprobación en GenomeStudio por errores de agrupación antes de que se realicen más investigaciones.
Un fallido Infinium experimento de genotipado es probablemente debido a un error de procesamiento humano o ADN de entrada de baja calidad. Ejemplo de cuantificación debe ser exacta y precisa. Para obtener los mejores resultados, ningún reactivo añadido a cualquier muestra o chip deben ser dispensadas en el volumen establecido por el protocolo. Las pipetas se calibran correctamente. Los reactivos no deben ejecutarse después de la caducidad y no deben volver a congelarse una vez descongelado, salvo para el reactivo RA1. Con el fin de minimizar los posibles errores de tinción y extensión, la mezcla formamida / EDTA debe estar preparado fresco cada mes. Todos los -20 ° C, los reactivos deben almacenarse en sólo congeladores de descongelación manual. Todo el material de laboratorio utilizado en la víaaining, de extensión y de lavado de partes del protocolo se deben enjuagar bien con agua y detergente suave inmediatamente después de dejar de usar. Los depósitos en la cámara de humidificación hyb se deben lavar con un cepillo de tubo de ensayo y un detergente suave. Las placas de vidrio se deben lavar con lejía al 10%, según las instrucciones de sus manuales de usuario, una vez a la semana.
The authors have nothing to disclose.
La financiación de este trabajo ha sido proporcionada por NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 y NIH R56 AI063274
Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |