Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen
Summary
Ein Protokoll beschrieben, das Illumina Infinium Assays verwendet, um groß angelegte Genotypisierung. Diese Assays zuverlässig Millionen SNPs Genotyp über Hunderte von einzelnen DNA-Proben in drei Tagen. Einmal erzeugt, können diese Genotypen verwendet werden, um für Vereine mit einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen oder Phänotypen zu überprüfen.
Abstract
Genotypisierung Varianten des menschlichen Genoms hat sich als ein wirksames Verfahren, um genetische Assoziationen Phänotypen identifizieren. Die Verteilung der Varianten innerhalb der Familien oder Populationen kann die Identifizierung der genetischen Faktoren der Erkrankung zu erleichtern. Panel der Genotypisierung BeadChips Illumina ermöglicht Ermittler zu Tausenden oder Millionen von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) Genotyp oder an andere genomische Varianten, wie Kopienzahl, über eine große Anzahl von DNA-Proben zu analysieren. Diese SNPs können über das gesamte Genom verteilt oder in bestimmten Regionen, um potenzielle Entdeckungen zu maximieren richtet sein. Die Infinium-Assay wurde optimiert, um hochwertige, schnell genaue Ergebnisse liefern. Bei richtiger Konfiguration können ein Techniker von einigen hundert bis zu über tausend DNA-Proben pro Woche zu verarbeiten, abhängig von der Art der Anordnung. Dieser Test führt den Benutzer durch jeden Schritt, ausgehend von genomischer DNA und endend mit dem Scannen des Arrays. Mit Anstand Reagents werden Proben verstärkt, fragmentiert, gefällt, resuspendiert, auf dem Chip, um eine einzelne Base, gebeizt erweitert hybridisiert und entweder auf einem iScan oder Hallo Scan hochauflösende optische Abbildungssystem gescannt. Eine Nacht Schritt erforderlich, um die DNA zu amplifizieren. Die DNA wird denaturiert und isotherm durch Amplifikation des gesamten Genoms amplifiziert, daher ist kein PCR erforderlich. Proben werden über Nacht in einem zweiten Schritt auf die Arrays hybridisiert. Am dritten Tag werden die Proben nun gescannt und analysiert werden. Amplifizierte DNA kann in großen Mengen gelagert werden, so dass Perlenanordnungen jeden Tag der Woche verarbeitet werden, wodurch der Durchsatz maximiert wird.
Introduction
Typing Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) ist eine wichtige Methode zur Identifizierung mit der Krankheit assoziiert Risikovarianten. Historisch ist der Umfang der Genotypisierungsanalysen durch die verfügbare Technologie begrenzt. Gelelektrophorese-basierte Genotypisierung Methoden werden in Abtast-und SNP-Durchsatz begrenzt ist [1]. Die Entwicklung dieser Tests können oft arbeitsintensiv sein, die sich auf dem Make-up und Struktur der Region die Variante für die Optimierung Umgebung [1]. TaqMan-Assays Genotypisierung von Life Technologies entwickelt wurde, kann eine große Anzahl von Proben schnell und mit minimalen Beteiligung Techniker laufen [2], aber SNP-Multiplex Einschränkungen weiterhin die Gesamtzahl der Genotypen auf deutlich unter eine Million pro Tag [3,4 begrenzen ]. Sequenoms Iplex Plattform kann auch viele Proben laufen auf einmal, aber, da weniger als hundert SNPs können zusammen gemultiplext werden, ist vergleichsweise geringen Gesamtdurchsatz [5]. Beckman Coulter SNP-Stream-Technologiekönnte theoretisch produzieren mehr als drei Millionen Genotypen pro Tag, aber diese Technik Grenzen Projektbereich zu einem Maximum von nur achtundvierzig SNPs pro Reaktion [4,6]. Während die Goldengate-Test kann fast zweihundert DNA-Proben jeden Tag auf Hunderten oder Tausenden von SNPs pro Probe zu verarbeiten, ist der Preis pro Genotyp nicht wettbewerbsfähig mit erweiterten, ultra-Hochdurchsatz-Techniken bei der Eingabe über dreitausend SNPs auf einmal [4,7 ]. Um mehrere Millionen Genotypen pro Tag verarbeiten, die für große Genom-weite Assoziationsstudien erforderlich Skala, Array-Hybridisierungstests haben sich die kostengünstigste Option auf dem Markt.
Affymetrix-Linie von Hybridisierungsarrays und Illumina-Linie von Infinium-basierte Arrays ermöglichen potenziell Hunderte von Proben auf Hunderttausende oder Millionen von SNPs parallel [4,8] eingegeben werden. Diese SNPs können über das gesamte Genom verstreut werden, in Regionen, von Interessen, wie Ex lokalisiertomes oder den Vorlieben des Benutzers angepasst. Diese Arrays haben den Vorteil, nicht nur in der Lage, eine Million SNPs pro Probe genau Genotyp auf einmal, aber auch Kopienzahl Variation zu messen, potenziell Enthüllung Chromosomenanomalien. Infinium ausgerichtet OMNI BeadChip Arrays haben derzeit die Möglichkeit, Genotyp bis zu fast fünf Millionen Marker pro Probe, darunter eine halbe Million individuelle Loci, auf bis zu fast hundert Proben pro Tag.
Da die meisten Krankheiten haben eine genetische Komponente, können diese Großversuche entscheidend bei der Suche nach Genen, die mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Hochdurchsatz-Genotypisierung ermöglicht eine effiziente Genotyp Generation in der Probe setzt groß genug, um genetische Assoziation zeugend erkennen zu niedrigeren kleinere Allel-Frequenzen. [9,10,11] Whole Genome Genotypisierung Projekte verwendet werden, um Regionen mit statistisch signifikanten Fall-Kontroll-Allel Frequenz oder Kopienzahl Unterschiede zu lokalisieren. Nach Angaben der Nationalen Menschen Genome Research Institute, führte genomweite Assoziationsstudien, um 1490 getrennte Publikationen zwischen dem 25. November 2008 und dem 25. Januar 2013, die sich aus der Entdeckung von 8.283 SNPs mit einem p-Wert von weniger als 1 x 10 -5 (siehe http:// www.genome.gov/gwastudies/). Diese Studien, die Bedingungen von Höhe zu Hodenkrebs, profitierte von der breiten Ansatz durch eine genomweite Analyse ergab erforscht. In Fällen wie diesen, kann ganze Regionen von Interesse entgangen war der Umfang der Typisierung war zu restriktiv. So kann zum Großverband analysiert, ist eine genomweite Genotypisierung Technik die Technik der Wahl.
Verschiedene Versionen des Infinium Assay vorhanden ist, jeweils für die Verwendung mit bestimmten Typen von Arrays bestimmt. Die InfiniumUltra Assay, in der Tiefe unten diskutiert wird, ist angemessen für viele 12 – oder 24-Sample-Array-Chips. Diese oft Genotyp über hunderttausend SNPs pro DNA-Probe und konzentrieren sich auf targeted Regionen, wie auf exome oder benutzerdefinierte Panels. Andere Assay-Versionen können für andere Chiptypen, wie z. B. die Gesamtgenom-Genotypisierung Arrays erforderlich. Da jedoch alle Infinium Assays haben eine gemeinsame Grundlage und unterscheiden sich hauptsächlich nur von den Reagenz-Name, der Reagenzienmengen, oder die genaue Färbereagenz Verfahren, Techniken, die auf einem Test-Version perfektioniert kann oft universell einsetzbar. Andere Felder wie Methylierung Arrays könnte eine nahezu identische Protokoll verwenden, wie gut. Es muss nur genommen die Version des für die Chip-Typ im Einsatz erforderlich Assay werden. Einige Arten, wie beispielsweise diejenigen Messung der Genexpression Ebene könnten die Verwendung eines nonInfinium Protokoll.
Die Proben müssen in Chargen verarbeitet werden. Zum Beispiel mit dem InfiniumUltra Assay enthalten Prähybridisierung Reagenzröhrchen genug Volumen zu 96 Proben laufen, und die Rohre können nicht wieder eingefroren werden. Daher müssen Proben in Chargen von 96 Proben zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden. Die Proben werden auf den Tannen verstärkt werdent Tag. Nach ca. 1 h Rohbau, müssen die Proben in einem Umluftofen für 20-24 Stunden erhitzt werden. Am folgenden Tag wird fast 4 h ausgegeben werden Fragmentierungs, Ausfällen und Resuspendieren der Proben, an welchem Punkt können die Proben entweder für zukünftige Verwendung eingefroren oder auf dem Chip hybridisiert werden. Lädt Chips dauert fast 2 Stunden, nach dem die Proben über Nacht für 16-24 h hybridisiert werden. Am dritten Tag erfolgt die Färbung und Verlängerungsschritt ~ 4 Stunden. Eine weitere Stunde ausgegeben werden Wasch-, Beschichten und Trocknen der Späne. Schließlich werden die Matrizen gescannt, die 15-60 min / Chip dauern kann, abhängig von der Art verwendet.
Standard-Labor Sicherheit und Sauberkeit Vorsichtsmaßnahmen gelten. Obwohl die Amplifikation nicht PCR-basierten, sind separate Arbeitsstationen für Vor-und postamplification Verfahren notwendig, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Die Identifikationsnummer eines jeden Kit gelieferten Reagenzien im Einsatz muss auf einer Tracking-Blatt angemeldet sein. Reagents sollten unmittelbar vor Gebrauch mehrmals vor der Abgabe aufgetaut und umgekehrt werden. Die getippt werden müssen DNA hochwertige genomische DNA (260/280 Absorptionsverhältnis von 1,6 bis 2,0, 260/230 Absorptionsverhältnis von unter 3,0), nach Standardmethoden isoliert und mit einem Fluorometer quantifiziert werden. Abbau von DNA ist oft ein Faktor in geringer Qualität Assay-Ergebnisse. Typischerweise wird 200 ng DNA benötigt wird, obwohl dieser Betrag kann für einige Chiptypen variieren. Ein Tecan Flüssigkeitshandhabungsroboter kann viele Schritte des Protokolls zu automatisieren und menschliche Fehler zu minimieren als Faktor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Groß Genotypisierung Anwendungen verwendet worden, um den genetischen Mechanismus viele menschliche Krankheiten zugrunde liegen, besser zu verstehen. Die Entdeckung einer signifikanten Variante durch eine genomweiten Assoziationsanalyse kann eine Kandidatenregion für die weitere Untersuchung Flagge. Darüber hinaus ist Genotyp Daten ein gutes Werkzeug für die Qualitätskontrolle auf Sequenzierungsprojekten.
Um Probendurchsatz zu maximieren, können mehrere Probenplatten verstärkt und in ihrer fragmentiert, resuspendierten Staaten gespeichert werden. Acht Platten können an einem einzigen Tag verstärkt werden, die Kombination der ersten 24 Stunden des Protokolls für mehrere Chargen und Bereitstellung von genügend Material für ~ 2-8 Tagen Chip-Verarbeitung. Wenn Platten verstärkt werden vorher gehortet, und wenn neue Proben auf Chips hybridisiert sofort nach dem Scanvorgang beginnt mit dem vorherigen Lauf, kann die Verarbeitung kontinuierlich, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Probenvorbereitung Pause laufen. Daher wird zwar Proben drei Tage zu unterziehen die kompletteAssays können Daten täglich erzeugt. Assuming24 Chips werden jeden Tag verarbeitet werden, ermöglicht über ein 1.000 DNA-Proben auf einer 12-Sample-Wulst-Chip ausgeführt werden 5 Tage-Woche. Wenn jeder Schritt oder Reagenz ausgefallen ist, aber mehrere Batches könnte mit einem Risiko für eine schlechte Leistung sein, bevor eine Korrektur angewendet werden kann. Fehler können sich Aufmerksamkeit entgehen, bis die Arrays werden gescannt oder analysiert, daher, wenn der Durchsatz maximiert, Hunderte von Proben in verschiedenen Stadien des Protokolls vielleicht schon das gleiche fehlerhafte Behandlung nach Entdeckung erhielt. Wie verloren Reagenzien und Daten nicht wiederhergestellt werden können, muss der Benutzer diese Risiken gegen die Notwendigkeit einer beschleunigten Workflow wiegen.
Die Genome Analyse-Software ist die erste Chance, um wirklich beurteilen den Erfolg der Genotypisierung Prozess. Wenn die Norm-R vs Norm-Theta Intensität Stücke richtig gruppiert sind, sollte die durchschnittliche Anrufrate (Prozent des Gesamt SNPs erfolgreich typisiert) der Proben nähern sich 99%, obwohl dieser Wert variiert slightly je nach Array-Typ. Die Daten von jeder Probe mit einem Anrufrate niedriger als 85-90% ist nicht vertrauenswürdig und muss verworfen werden. Für die Qualitätskontrolle, sollten die Ergebnisse zu allen bisher bekannten Genotypen, wann immer möglich verglichen werden. Wenn keine solche Daten vorhanden sind, ist gewollt Probe Vervielfältigung ein nützliches Werkzeug bei der Überprüfung Platte oder Array-Platzierungen. Diese doppelten Paare sollten auf getrennten Chips, Platten, Chargen, oder Projekte gelegt werden, deren Genotypen bei der Erzeugung überprüft. Während spezifische QC Einschränkungen variieren je nach den Prüfer bevorzugt werden gemeinsame SNP Einschränkungen Beispielaufruf Erfolg, Hardy-Weinberg-Gleichgewicht oder missingness zwischen Fällen und Kontrollen, basiert, während gemeinsame Probe Einschränkungen werden auf Tarife für Gespräche, Mendel Unstimmigkeiten oder Querverweise auf Basis X-Chromosom Heterozygotie der klinischen Daten Geschlecht [13].
Wenn ein Problem auftritt, die Controls-Armaturenbrett, in der Analyse-Suite gefunden wird, kann die eingereicht werdenUnternehmen, um Ursache zu ermitteln. Diese Kontrollen können oft verengen das Thema auf die wahrscheinlichste Schritt oder Reagenzienversagen. Falls SNPs von Interesse sind durch eine Genotypisierung Infinium Experiment gefunden, sollten ihre Intensität Stücke doppelt überprüft in Genome für Clustering Fehler, bevor weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
Ein fehlgeschlagener Versuch Infinium Genotypisierung ist wahrscheinlich auf menschliche Verarbeitungsfehler oder schlechte Qualität der eingesetzten DNA. Beispiel Quantifizierung müssen genau und präzise sein. Für beste Ergebnisse, alle Reagenzien hinzugefügt, um jede Probe oder Chip muss an der mit dem Protokoll festgelegten Volumen verzichtet werden. Pipetten sind ordnungsgemäß zu kalibrieren. Reagenzien dürfen nach Ablauf ausgeführt werden und sollte nicht einmal aufgetaut wieder eingefroren werden, mit Ausnahme der RA1 Reagenz. Um mögliche Färbung und Verlängerung Fehler zu minimieren, sollte das Formamid / EDTA-Mischung jeden Monat frisch zubereitet werden. Alle -20 ° C Reagenzien werden in nur manuelle Abtauen Gefriergeräte gelagert werden. Alle Laborgeräte in der st verwendetaining, Erweiterung und Wasch Teile des Protokolls sollten gründlich mit Wasser und einem milden Reinigungsmittel sofort bei Nichtgebrauch ausgespült werden. Die Befeuchtung Stauseen in der hyb Kammer sollte mit einem Reagenzglas Bürste und einem milden Reinigungsmittel gewaschen werden. Die Glasobjektträger mit 10% Bleichmittel gewaschen werden, wie durch ihre Benutzerhandbüchern angewiesen, einmal pro Woche.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 und NIH R56 AI063274 versehen worden
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
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