Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications
Summary
Un protocole est décrit qui utilise les tests de Infinium d'Illumina pour effectuer le génotypage à grande échelle. Ces dosages peuvent fiable génotype millions de SNP à travers des centaines d'échantillons d'ADN individuels en trois jours. Une fois généré, ces génotypes peuvent être utilisés pour vérifier les associations avec une variété de différentes maladies ou phénotypes.
Abstract
variantes de génotypage du génome humain s'est avérée être une méthode efficace pour identifier les associations génétiques des phénotypes. La distribution des variantes au sein des familles ou des populations peut faciliter l'identification des facteurs génétiques de la maladie. Le panneau d'Illumina de BeadChips de génotypage permet aux enquêteurs de génotype des milliers ou des millions de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou d'analyser d'autres variantes génomiques, tels que le nombre de copie, à travers un grand nombre d'échantillons d'ADN. Ces SNP peuvent être répartis sur tout le génome ou ciblées dans des régions spécifiques afin de maximiser le potentiel de découverte. L'essai Infinium a été optimisé pour obtenir rapidement de haute qualité, des résultats fiables. Avec une configuration correcte, un seul technicien peut traiter de quelques centaines à plus d'un millier d'échantillons d'ADN par semaine, selon le type de tableau. Ce test guide les utilisateurs à travers chaque étape, en commençant par l'ADN génomique et se terminant avec le balayage de la matrice. Utilisation de bienséance Reagents, les échantillons sont amplifiés, fragmenté, précipité, remis en suspension, hybridé à la puce, prolongée par une base unique, souillé, et scanné soit sur un système d'imagerie optique à haute résolution iScan ou Salut Scan. Une étape d'une nuit est nécessaire pour amplifier l'ADN. L'ADN est dénaturé et isotherme amplifié par amplification du génome entier et, par conséquent, pas de PCR est nécessaire. Les échantillons sont hybridées aux puces à ADN au cours d'une seconde étape d'une nuit. Dès le troisième jour, les échantillons sont prêts à être numérisée et analysée. L'ADN amplifié peut être stocké en grandes quantités, ce qui permet des arrangements de billes à traiter chaque jour de la semaine, en maximisant ainsi le débit.
Introduction
Taper polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) est une méthode clé de l'identification des variantes de risque associés à la maladie. Historiquement, le champ d'application de génotypage a été limitée par la technologie disponible. méthodes de génotypage basés sur l'électrophorèse sur gel sont limitées dans l'échantillon-et SNP-débit [1]. Le développement de ces tests peut souvent être main-d'œuvre, en s'appuyant sur la composition et la structure de la région entourant la variante pour l'optimisation [1]. TaqMan de génotypage, développé par Life Technologies, peuvent exécuter un grand nombre d'échantillons rapidement et avec la participation de technicien minimal [2], mais les restrictions SNP-multiplexage continuent de limiter le nombre total de génotypes à bien moins d'un million par jour [3,4 ]. La plate-forme iPlex Sequenom peut également exécuter plusieurs échantillons à la fois, mais, étant donné que moins d'une centaine de SNPs peuvent être multiplexés, ce débit est comparable globalement faible [5]. La technologie de flux SNP de Beckman Coulterpourrait théoriquement produire plus de trois millions de génotypes par jour, mais cette gamme limites de la technologie du projet à un maximum de seulement quarante-huit SNPs par réaction [4,6]. Bien que l'essai GoldenGate peut traiter près de deux cents échantillons d'ADN chaque jour sur des centaines ou des milliers de SNP par exemple, le prix par génotype n'est pas compétitif avec des techniques ultra-haut débit de pointe lors de la saisie de plus de trois mille SNP à la fois [4,7 ]. Afin de traiter plusieurs millions de génotypes par jour, à l'échelle requise pour les grandes études d'association pangénomique, analyses tableau d'hybridation sont devenus l'option la plus rentable sur le marché.
La ligne de Affymetrix de tableaux d'hybridation et de la ligne d'Illumina de tableaux basés sur Infinium permettent potentiellement des centaines d'échantillons à taper sur des centaines de milliers ou des millions de SNP en parallèle [4,8]. Ces SNP peuvent être dispersés sur l'ensemble du génome, localisée dans les régions d'intérêt, tels que les exomes, ou sur mesure selon les préférences de l'utilisateur. Ces tableaux ont l'avantage d'être non seulement en mesure de déterminer le génotype précision d'un million de SNPs par échantillon à la fois, mais aussi de mesurer la variation du nombre de copies, des anomalies chromosomiques potentiellement dévoilement. Infinium alignés tableaux OMNI BeadChip ont actuellement la capacité de génotype à près de cinq millions de marqueurs par échantillon, y compris un demi-million de loci de coutume, sur un maximum de près d'une centaine d'échantillons chaque jour.
Comme la plupart des maladies ont une composante génétique, ces expériences à grande échelle peuvent être crucial dans la recherche des gènes associés à la maladie. Génotypage à haut débit permet de production efficace de génotype dans l'échantillon fixe suffisante pour détecter de façon convaincante association génétique à des fréquences des allèles mineurs inférieurs. Projets de génotypage du génome entier peuvent être utilisés pour localiser des régions avec statistiquement significative cas-contrôle la fréquence des allèles ou des différences du nombre de copies [9,10,11]. Selon le National Human GeInstitut de recherche nome, les études d'association du génome a conduit à 1490 publications distinctes entre le 25 Novembre 2008 et le 25 Janvier 2013, découlant de la découverte de 8283 SNP avec une p-valeur inférieure à 1 x 10 -5 (voir http:// www.genome.gov/gwastudies/). Ces études, qui fait des recherches sur des conditions allant de la hauteur de cancer du testicule, bénéficié de l'approche globale offerte par une analyse de l'ensemble du génome. Dans de tels cas, des régions entières d'intérêt pourraient avoir échappé à l'attention avait la portée de taper trop restrictive. Ainsi, pour les analyses d'association à grande échelle, une technique de génotypage du génome est la technique de choix.
Différentes versions de l'essai Infinium existent, chacun destiné à être utilisé avec des types spécifiques de tableaux. Le dosage InfiniumUltra, discuté en détail ci-dessous, est approprié pour beaucoup 12 – ou 24-échantillons des puces de tableau. Ce génotype souvent plus de cent mille SNP par échantillon d'ADN et de se concentrer sur trégions argeted, comme sur exome ou personnalisés panneaux. D'autres versions de dosage peuvent être nécessaires pour d'autres types de puces, telles que les matrices de génotypage du génome entier. Cependant, comme tous les tests Infinium partagent une base commune et diffèrent principalement que par les noms de réactifs, les volumes de réactifs ou de la procédure de réactif de coloration exacte, techniques perfectionnées sur une seule version d'essai peuvent souvent être universellement appliquées. D'autres tableaux, comme les tableaux de méthylation, peuvent utiliser un protocole pratiquement identique, aussi bien. Il faut prendre soin de n'utiliser que la version du dosage requis pour le type de puce en cours d'utilisation. Certains types, tels que ceux mesurant le niveau d'expression des gènes, peuvent nécessiter l'utilisation d'un protocole de nonInfinium.
Les échantillons doivent être traitées par lots. Par exemple, avec le dosage InfiniumUltra, tubes de réactif de pré-hybridation contiennent un volume suffisant pour exécuter 96 échantillons, et les tubes ne peuvent être recongelés. Par conséquent, les échantillons doivent être analysés en lots de 96 échantillons à la fois. Les échantillons seront amplifiés sur les sapinst jour. Après environ 1 heure de travail d'établi, les échantillons doivent être chauffés dans un four à convection pendant 20-24 h. Le lendemain, près de 4 heures sera consacré fragmentation, la précipitation, et remise en suspension des échantillons, à quel point les échantillons peuvent être soit congelés pour une utilisation ultérieure ou hybridées sur la puce. Chargement puces prend près de 2 heures, après quoi les échantillons seront hybrides pendant une nuit pour 16-24 heures. Le troisième jour, l'étape de coloration et d'extension prend ~ 4 heures. Une heure supplémentaire sera consacré à laver, de revêtement, et le séchage des copeaux. Enfin, les tableaux sont analysés, ce qui peut prendre de 15 à 60 min / puce, selon le type utilisé.
Les précautions de sécurité de laboratoire et de propreté standard s'appliquent. Bien que basée sur la PCR de l'amplification n'est pas, les postes de travail séparés pour pré-et postamplification procédures sont nécessaires afin de minimiser la probabilité de contamination. Le numéro d'identification de chaque réactif du kit fourni dans l'utilisation doit être connecté sur une feuille de suivi. Reagents doivent être décongelés avant utilisation et immédiatement inversés plusieurs fois avant la distribution. L'ADN doit être dactylographié doit être de l'ADN génomique de haute qualité (260/280 rapport d'absorbance de 1,6-2,0, 260/230 rapport d'absorbance inférieure à 3,0), isolé par des méthodes classiques et quantifiés avec un fluorimètre. La dégradation de l'ADN est souvent un facteur contribuant dans les résultats d'analyse de qualité médiocre. Typiquement, 200 ng d'ADN est nécessaire, si ce montant peut varier pour certains types de puces. Un robot de liquide de traitement Tecan peut automatiser de nombreuses étapes du protocole et de minimiser l'erreur humaine comme un facteur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Applications de génotypage à grande échelle ont été utilisées pour mieux comprendre le mécanisme génétique sous-jacente de nombreuses maladies humaines. La découverte d'une variante importante grâce à une analyse de génome d'association peut signaler une région candidate pour une étude plus approfondie. En outre, les données de génotype est un bon outil pour le contrôle de la qualité des projets de séquençage.
Pour maximiser le débit d'échantillons, de plaques échantillons multiples peuvent être amplifiés et stockés dans leurs Etats, remis en suspension fragmentés. Huit plaques peuvent être amplifiées en une seule journée, en combinant les 24 premières heures du protocole pour plusieurs lots et de fournir suffisamment de matière pour ~ 2-8 jours de la puce de traitement. Si les plaques amplifiés sont stockées à l'avance, et si de nouveaux échantillons sont hybridées à des puces immédiatement après la numérisation commence sur la course précédente, le traitement peut fonctionner en continu sans avoir besoin de faire une pause pour la préparation de l'échantillon supplémentaire. Par conséquent, bien que les échantillons auront trois jours pour subir la complèteessai, les données peuvent être générés quotidiennement. copeaux de Assuming24 sont traitées chaque jour, une semaine de travail de 5 jours permet depuis plus de 1000 échantillons d'ADN pour être exécuté sur une puce de perles 12-échantillon. Si une étape ou réactif a échoué, cependant, plusieurs lots pourraient être à risque de mauvaise performance avant toute correction peut être appliquée. Des erreurs peuvent échapper à l'attention jusqu'à ce que les réseaux sont scannés ou analysés, par conséquent, si le débit est maximisé, des centaines d'échantillons à différents stades du protocole pourraient déjà avoir reçu le même traitement défectueux lors de la découverte. Comme les réactifs et les données perdues ne peuvent pas être récupérés, l'utilisateur doit peser ces risques contre la nécessité d'un flux de travail accéléré.
Le logiciel d'analyse GenomeStudio est la première occasion de mesurer réellement la réussite du processus de génotypage. Si la norme R-vs parcelles d'intensité Norm-Theta sont bien regroupés, le taux moyen de l'appel (pour cent du total SNP tapé avec succès) des échantillons devrait approcher 99%, bien que cette valeur varie sliselon ghtly le type de tableau. Les données de n'importe quel échantillon avec un taux inférieur à 85-90% d'appels n'est pas digne de confiance et doivent être jetés. À des fins de contrôle de la qualité, les résultats doivent être comparés à des génotypes déjà connues chaque fois que possible. Si aucune donnée n'existe, intentionnelle duplication de l'échantillon est un outil utile pour vérifier la plaque ou tableau placements. Ces paires en double doivent être placés sur des puces séparées, des assiettes, des lots, ou des projets; leurs génotypes vérifiés lors de la génération. Bien que les contraintes QC spécifiques varient en fonction de la préférence de l'enquêteur, les contraintes communes SNP sont basés sur la réussite exemple d'appel, Hardy-Weinberg, ou manquantes entre les cas et les témoins, tandis que les contraintes de l'échantillon communes sont basés sur les taux d'appel, les incohérences de Mendel, ou des références croisées de X-chromosome hétérozygotie des données cliniques entre les sexes [13].
En cas de problème, le tableau de bord des contrôles, a trouvé dans la suite de l'analyse, peut être soumis à laentreprise afin de déterminer la cause. Ces contrôles peuvent souvent limiter la question à l'étape la plus probable ou l'échec de réactif. Si des SNP d'intérêt se trouvent à travers une expérience de génotypage Infinium, leurs parcelles d'intensité doivent être vérifiées dans GenomeStudio pour les erreurs de regroupement avant est effectué de nouvelles recherches.
Une expérience de génotypage Infinium pas est probablement dû à une erreur de manipulation humaine ou l'ADN d'entrée de mauvaise qualité. quantification de l'échantillon doit être exacte et précise. Pour de meilleurs résultats, tous les réactifs ajoutés à un échantillon ou puce doivent être dispensés au volume fixé par le protocole. Les pipettes doivent être correctement calibrés. Réactifs ne doivent pas être exécutés après expiration et ne doivent pas être recongelés une fois décongelé, sauf pour le réactif RA1. Afin de minimiser les erreurs de coloration et de vulgarisation possibles, le mélange formamide / EDTA doit être préparé chaque mois. Tous les -20 C ° réactifs doivent être stockés dans des congélateurs à dégivrage non automatique seulement. Tout le matériel de laboratoire utilisé dans la mAining, de vulgarisation, et lavage des parties du protocole doivent être rincés abondamment à l'eau et un détergent doux dès désuétude. Les réservoirs d'humidification dans la chambre de hyb doivent être lavés avec une brosse en tube à essai et un détergent doux. Les lames de verre doivent être lavés avec l'eau de Javel à 10%, selon les instructions de leurs manuels de l'utilisateur, une fois par semaine.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de ce travail a été fourni par le NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, et les NIH R56 AI063274
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
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