Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني
Summary
يوصف بروتوكول يستخدم المقايسات Infinium البورشيد على أداء نطاق واسع التنميط الجيني. ويمكن لهذه المقايسات التركيب الوراثي موثوق الملايين من النيوكلوتايد عبر مئات من عينات الحمض النووي الفردية في ثلاثة أيام. مرة واحدة ولدت، هذه التراكيب الوراثية يمكن استخدامها للتحقق من الجمعيات مع مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة أو الظواهر.
Abstract
المتغيرات التنميط الجيني في الجينوم البشري وقد ثبت أن تكون وسيلة فعالة لتحديد الجمعيات الجينية مع الظواهر. توزيع المتغيرات داخل الأسر أو السكان يمكن أن تسهل التعرف على العوامل الوراثية للمرض. لوحة البورشيد من BeadChips التنميط الجيني يسمح المحققين إلى التركيب الوراثي الآلاف أو الملايين من تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (تعدد الأشكال) أو لتحليل المتغيرات الجيني أخرى، مثل عدد النسخ، عبر عدد كبير من عينات الحمض النووي. يمكن أن تنتشر هذه النيوكلوتايد في جميع أنحاء الجينوم أو المستهدفة في مناطق محددة من أجل تحقيق أقصى قدر من اكتشاف المحتملة. وقد تم تحسين مقايسة Infinium لانتاج عالية الجودة، ونتائج دقيقة بسرعة. مع الإعداد السليم، يمكن للفني واحد معالجة من بضع مئات إلى أكثر من ألف عينات من الحمض النووي في الأسبوع، وهذا يتوقف على نوع صفيف. هذا الاختبار أدلة المستخدمين من خلال كل خطوة، بدءا من الحمض النووي الجيني وتنتهي مع المسح الضوئي للمجموعة. باستخدام اللياقة reageاليلة، وتتضخم عينات، مجزأة، عجل، معلق، المهجنة إلى الرقاقة، وسعت من خلال قاعدة واحدة، الملون، ومسحها على أي نظام التصوير الضوئي عالية الدقة iScan أو مرحبا المسح الضوئي. مطلوب خطوة واحدة بين عشية وضحاها لتضخيم الحمض النووي. الحمض النووي هو التشويه والتحريف وتضخيمها من قبل isothermally كامل الجينوم التضخيم، وبالتالي، لا يلزم PCR. يتم تهجين العينات إلى صفائف خلال خطوة الثانية بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث، وعينات على استعداد ليتم فحصها وتحليلها. يمكن تخزينها تضخيم الحمض النووي بكميات كبيرة، مما يسمح صفائف حبة لتتم معالجة كل يوم من أيام الأسبوع، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية.
Introduction
كتابة الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) هو وسيلة أساسية لتحديد المتغيرات المخاطر المرتبطة بالمرض. تاريخيا، في نطاق التجارب التنميط الجيني قد يحد من التكنولوجيا المتاحة. أساليب التنميط الجيني استنادا الكهربائي جل محدودة في عينة وSNP-الإنتاجية [1]. يمكن تطوير هذه المقايسات غالبا ما تكون كثيفة العمالة، والاعتماد على الماكياج وبنية المنطقة المحيطة البديل الأمثل ل[1]. يمكن المقايسات TaqMan التنميط الجيني، التي وضعتها تقنيات الحياة، تشغيل عدد كبير من العينات بسرعة وبأقل قدر من تدخل فني [2]، ولكن لا تزال القيود SNP-المتنوعة للحد من عدد من المورثات إلى ما تحت المليون في اليوم الواحد [3،4 ]. منصة Sequenom في IPLEX يمكن أيضا تشغيل العديد من العينات في وقت واحد، ولكن، كما يقل عن مائة النيوكلوتايد يمكن المضاعفة معا، الإنتاجية منخفضة نسبيا بشكل عام [5]. تكنولوجيا تيار SNP بيكمان كولتر ومن الناحية النظرية يمكن أن تنتج أكثر من ثلاثة ملايين المورثات في اليوم الواحد، ولكن هذا المشروع مجموعة حدود التكنولوجيا إلى حد أقصى قدره ثماني وأربعين فقط النيوكلوتايد في رد فعل [4،6]. بينما يمكن للفحص GoldenGate معالجة ما يقرب من مائتي عينات من الحمض النووي في كل يوم على مئات أو آلاف من تعدد الأشكال لكل عينة، والثمن في التركيب الوراثي ليست تنافسية مع متقدمة، وتقنيات فائقة الإنتاجية عند كتابة اكثر من ثلاثة آلاف تعدد الأشكال في وقت واحد [4،7 ]. من أجل معالجة عدة ملايين من المورثات في اليوم الواحد، والنطاق المطلوب لدراسات كبيرة الجينوم على نطاق الرابطة، أصبحت مجموعة المقايسات التهجين الخيار الأكثر فعالية من حيث التكلفة في السوق.
خط [أفمتريإكس] من صفائف التهجين وخط البورشيد من صفائف استنادا Infinium-تسمح يحتمل مئات العينات المراد كتابتها على مئات الآلاف أو الملايين من النيوكلوتايد بالتوازي [4،8]. يمكن أن تكون منتشرة في جميع أنحاء هذه النيوكلوتايد الجينوم بأكمله، مترجمة في مناطق المصالح، مثل السابقينOMES، أو مخصصة لتفضيل المستخدم. هذه المصفوفات والاستفادة من كونها ليس فقط قادرا على التركيب الوراثي بدقة مليون النيوكلوتايد لكل عينة في وقت واحد، ولكن أيضا لقياس التباين في عدد النسخ، شذوذ الكروموسومات يحتمل الستار. Infinium الانحياز صفائف OMNI BeadChip دينا حاليا القدرة على التركيب الوراثي يصل إلى ما يقرب من خمسة ملايين علامات لكل عينة، بما في ذلك نصف مليون مواضع مخصصة، على عدد يصل إلى ما يقرب من مائة عينات كل يوم.
حيث أن معظم الأمراض يكون لها عنصر وراثي، يمكن لهذه التجارب على نطاق واسع أن يكون حاسما في إيجاد الجينات المرتبطة بالمرض. عالية الإنتاجية التنميط الجيني الوراثي يسمح لتوليد كفاءة في عينة مجموعات كبيرة بما يكفي للكشف مقنع جمعية الوراثية في انخفاض الترددات أليل طفيفة. مشاريع التنميط الجيني كامل الجينوم يمكن أن تستخدم لتحديد المناطق ذات الحالات والشواهد تردد أليل ذات دلالة إحصائية أو الاختلافات في عدد النسخ [9،10،11]. وفقا لقه البشرية الوطنيةمعهد بحوث نومي، بقيادة جمعية دراسات الجينوم على نطاق 1،490 إلى منشورات منفصلة بين 25 نوفمبر 2008 و 25 يناير 2013، انطلاقا من اكتشاف 8،283 تعدد الأشكال مع ف قيمة أقل من 1 × 10 -5 (انظر الإلكتروني http:// www.genome.gov/gwastudies/). هذه الدراسات، والتي بحثت الظروف التي تتراوح بين ارتفاع لسرطان الخصية، واستفاد من نهج واسع النطاق التي يوفرها التحليل على نطاق الجينوم. في مثل هذه الحالات، مناطق بأكملها من الفائدة قد هربوا إشعار قد نطاق الكتابة كانت مقيدة للغاية. وبالتالي، ليحلل جمعية على نطاق واسع، وهي تقنية التنميط الجيني على نطاق الجينوم هو الأسلوب في الاختيار.
إصدارات مختلفة من الفحص Infinium موجودة، كل المعدة للاستخدام مع أنواع معينة من المصفوفات. مقايسة InfiniumUltra، التي نوقشت في عمق أدناه، هو مناسبة لكثير من 12 – أو 24 عينة رقائق صفيف. هذه غالبا ما التركيب الوراثي أكثر من مائة ألف النيوكلوتايد لكل عينة الحمض النووي والتركيز على رargeted المناطق، مثل على لوحات exome أو العرف. قد تكون هناك حاجة الإصدارات مقايسة أخرى لأنواع شرائح أخرى، مثل صفائف التنميط الجيني كامل الجينوم. لكن، وكما تشترك جميع المقايسات Infinium أساس مشترك وتختلف أساسا إلا من خلال أسماء كاشف، كاشف وحدات التخزين، أو الإجراء المحدد تلطيخ كاشف، وتقنيات الكمال على نسخة فحص واحد كثيرا ما يمكن تطبيقه عالميا. المصفوفات الأخرى، مثل صفائف مثيلة، قد تستخدم بروتوكول متطابقة تقريبا، كذلك. يجب الحرص على استخدام الإصدار فقط للمقايسة المطلوبة لنوع رقاقة في الاستخدام. بعض الأنواع، مثل تلك الجينات قياس مستوى التعبير، قد تتطلب استخدام بروتوكول nonInfinium.
يجب أن تتم معالجة عينات على دفعات. على سبيل المثال، مع مقايسة InfiniumUltra، وأنابيب prehybridization كاشف تحتوي على ما يكفي لتشغيل 96 حجم العينات، والأنابيب لا يمكن أن أعيد تجميدها مرة أخرى. لذلك، يجب تشغيل العينات على دفعات من 96 عينات في وقت واحد. سوف تتضخم عينات على التنوبر اليوم. بعد ما يقرب من 1 ساعة من benchwork، يجب تسخين العينات في الفرن الحراري ل20-24 ساعة. في اليوم التالي، وسيتم إنفاق ما يقرب من 4 ساعات تفتيت، مما عجل، وإعادة التعليق العينات، وعند هذه النقطة العينات يمكن أن تكون إما مجمدة لاستخدامها في المستقبل أو المهجنة إلى الرقاقة. تحميل رقائق يأخذ ما يقرب من 2 ساعة، وبعد ذلك سيتم تهجين العينات بين عشية وضحاها ل16-24 ساعة. في اليوم الثالث، فإن الخطوة تلطيخ والإرشاد يأخذ ~ 4 ساعة. وسيتم إنفاق المزيد من ساعة والغسيل، والطلاء، وتجفيف رقائق البطاطس. أخيرا، يتم فحص صفائف، التي قد تستغرق 15-60 دقيقة / رقاقة، وهذا يتوقف على نوع استخدامها.
تطبيق سلامة المختبرات والنظافة الاحتياطات القياسية. وإن لم يكن يستند PCR-التضخيم، ومحطات العمل منفصلة عن إجراءات ما قبل وpostamplification ضرورية من أجل تقليل احتمالات التلوث. يجب أن يتم تسجيل رقم هوية كل كاشف الموفر في استخدام عدة على ورقة تتبع. Reageيجب إذابة اليلة فورا قبل الاستخدام ومقلوب عدة مرات قبل صرفها. يجب أن يكون الحمض النووي لأن تكتب عالية الجودة الحمض النووي الجيني (260/280 نسبة الامتصاصية من 1،6-2،0، 260/230 نسبة امتصاص أدناه 3.0)، معزولة بالطرق العادية وكميا مع التألق. تدهور الحمض النووي وغالبا ما يكون عاملا مساهما في نتائج الفحص منخفضة الجودة. عادة، مطلوب 200 نانوغرام من الحمض النووي، ورغم أن هذا المبلغ قد تختلف عن بعض أنواع رقاقة. A TECAN مناولة السائل الروبوت يمكن أتمتة العديد من الخطوات للبروتوكول وتقليل الخطأ البشري باعتباره عاملا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت تطبيقات التنميط الجيني على نطاق واسع لفهم أفضل لآلية الوراثية الكامنة وراء العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. اكتشاف أي متغير كبير من خلال تحليل الجينوم على نطاق الرابطة يمكن وضع علامة على المنطقة مرشحة لمزيد من الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، بيانات التركيب الوراثي هو وسيلة جيدة لمراقبة الجودة في مشاريع التسلسل.
لتعظيم الإنتاجية العينة، لوحات عينة متعددة يمكن تضخيمها وتخزينها في، الدول معلق مجزأة بهم. قد تتسع ثمانية لوحات في يوم واحد، والجمع بين ساعة 24 الأولى من بروتوكول للدفعات متعددة، وتوفير ما يكفي من المواد ل~ 2-8 أيام من تجهيز رقاقة. إذا تم تخزينها لوحات تضخيمها من قبل، وإذا تم تهجين عينات جديدة لرقائق فورا بعد بدء المسح على المدى السابق، يمكن معالجة بشكل مستمر دون الحاجة إلى وقفة لإعداد عينة إضافية. لذلك، على الرغم من عينات سوف يستغرق ثلاثة أيام للخضوع الكاملالفحص، يمكن توليد البيانات اليومية. تتم معالجة رقائق Assuming24 كل يوم، أسبوع العمل 5 أيام يسمح لأكثر من 1،000 عينات من الحمض النووي ليتم تشغيلها على حبة رقاقة 12 عينة. إذا أي خطوة أو كاشف فشلت، ومع ذلك، دفعات متعددة قد تكون في خطر لضعف الأداء قبل أن يتم تطبيق أي تصحيح. أخطاء قد يفلت من إشعار حتى يتم فحص صفائف أو تحليلها، وبالتالي، إذا تم تكبير الإنتاجية، قد تلقى مئات العينات في مراحل مختلفة من البروتوكول بالفعل نفس المعاملة المعيبة عند الاكتشاف. كما الكواشف والبيانات المفقودة لا يمكن استردادها، يجب على المستخدم تزن ضد هذه المخاطر ضرورة لسير عمل متسارعة.
برنامج تحليل GenomeStudio هي الفرصة الأولى لقياس حقا نجاح عملية التنميط الجيني. إذا تتجمع نورم-R مقابل القواعد والمعايير كما ثيتا المؤامرات كثافة بشكل صحيح، يجب أن متوسط سعر المكالمة (في المئة من إجمالي النيوكلوتايد كتبته بنجاح) من العينات تقترب من 99٪، على الرغم من هذه القيمة تتفاوت سليghtly اعتمادا على نوع صفيف. البيانات من أي عينة مع سعر المكالمة أقل من 85-90٪ ليست جديرة بالثقة، وينبغي التخلص منها. لأغراض مراقبة الجودة، وينبغي مقارنة النتائج إلى أي المورثات المعروفة سابقا كلما كان ذلك ممكنا. في حالة وجود أي من هذه البيانات، المتعمد عينة الازدواجية هو أداة مفيدة في التحقق من لوحة أو مجموعة المواضع. ينبغي أن توضع هذه الأزواج مكررة على رقائق منفصلة، لوحات، دفعات، أو المشاريع؛ المورثات الخاصة بهم على فحص جيل. في حين تختلف القيود QC محددة وفقا لتفضيل المحقق، تستند القيود المشتركة SNP على نجاح الدعوة العينة، هاردي واينبرغ، التوازن، أو missingness بين الحالات والضوابط، في حين تستند القيود عينة مشتركة بشأن أسعار المكالمات، التناقضات المندلية، أو إحالات من كروموسوم X-تغاير الزيجوت إلى البيانات السريرية بين الجنسين [13].
إذا نشأ أي مشكلة، لوحة التحكم، وجدت في جناح التحليل، يمكن تقديمه إلىالشركة من أجل تحديد السبب. ويمكن لهذه الضوابط في كثير من الأحيان تضييق القضية الى المرجحة خطوة أو فشل كاشف. إذا تم العثور على أي تعدد الأشكال من الاهتمام من خلال تجربة التنميط الجيني Infinium، ينبغي أن يكون المؤامرات كثافتها المزدوج التحقق من وجود أخطاء في GenomeStudio المجموعات قبل أن يتم إجراء المزيد من البحوث.
هو على الأرجح بسبب خطأ معالجة الإنسان أو الحمض النووي مدخلات ذات نوعية رديئة تجربة التنميط الجيني Infinium فشلت. يجب أن تكون العينة الكمي صحيحة ودقيقة. للحصول على أفضل النتائج، وأضاف أي الكواشف إلى أي عينة أو يجب الاستغناء رقاقة في حجم حددها البروتوكول. ماصات يجب معايرة بشكل صحيح. يجب عدم تشغيل الكواشف بعد انتهاء وينبغي ألا أعيد تجميدها مرة أخرى إذابة مرة واحدة، باستثناء كاشف RA1. من أجل تقليل تلطيخ والإرشاد الأخطاء المحتملة، ينبغي إعداد خليط الفورماميد / EDTA جديدة كل شهر. يجب أن يتم تخزين جميع -20 ° C الكواشف في المجمدات دليل تذويب فقط. جميع معدات المختبرات المستخدمة في الحادي وaining، ينبغي أن تشطف التمديد، وغسل أجزاء من بروتوكول جيدا بالماء والمنظفات معتدل فور الترك. يجب أن تكون نقيت الخزانات الرطوبة في غرفة HYB مع فرشاة أنبوب اختبار ومعتدل المنظفات. يجب غسلها الشرائح الزجاجية مع التبييض 10٪، وفقا لتعليمات أدلة المستخدم الخاصة بهم، مرة واحدة في الأسبوع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM103456 P20، المعاهد الوطنية للصحة RC2 AR058959، والمعاهد الوطنية للصحة R56 AI063274
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G., ed, . Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. . Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
