Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem
Summary
Um protocolo é descrito que utiliza ensaios Infinium Illumina para realizar genotipagem em larga escala. Estes ensaios podem genótipo de forma confiável milhões de SNPs em centenas de amostras de DNA individuais em três dias. Uma vez gerados, os genótipos pode ser usado para verificar as associações com uma variedade de diferentes doenças ou fenótipos.
Abstract
Genotipagem variantes no genoma humano provou ser um método eficiente para identificar associações genéticas com fenótipos. A distribuição de variantes dentro das famílias ou populações pode facilitar a identificação dos fatores genéticos da doença. Painel de BeadChips genotipagem da Illumina permite aos investigadores ao genótipo milhares ou milhões de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou analisar outras variantes genômicas, tais como número de cópias, através de um grande número de amostras de DNA. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma ou alvo em regiões específicas, a fim de maximizar o potencial de descoberta. O ensaio Infinium foi otimizado para produzir de alta qualidade, resultados precisos rapidamente. Com uma configuração adequada, um único técnico pode processar a partir de algumas centenas a mais de um milhar de amostras de ADN por semana, dependendo do tipo de matriz. Este ensaio orienta os usuários através de cada passo, começando com DNA genômico e terminando com a varredura da matriz. Usando decoro REAGEnts, as amostras são amplificados, fragmentado, precipitado, ressuspenso, hibridizado com o chip, prorrogado por uma única base, manchado, e digitalizadas em cada um de alta resolução sistema de imageamento óptico iScan ou Hi Scan. Um passo durante a noite é necessário para amplificar o ADN. O DNA é desnaturado e isotermicamente amplificado por amplificação de todo o genoma e, portanto, não é necessária a PCR. As amostras são hibridizadas para as matrizes durante um segundo passo durante a noite. No terceiro dia, as amostras estão prontas para serem digitalizados e analisados. O ADN amplificado pode ser armazenados em grandes quantidades, o que permite matrizes grânulo para ser processado a cada dia da semana, maximizando assim o rendimento.
Introduction
Digitando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) é um método fundamental de identificar variantes de risco associados à doença. Historicamente, o âmbito de experiências de genotipagem tiver sido limitados pela tecnologia disponível. Métodos de genotipagem baseadas em electroforese em gel estão limitadas na amostra e SNP throughput [1]. O desenvolvimento destes ensaios muitas vezes pode ser trabalhoso, contando com a composição e estrutura da região em torno da variante de otimização [1]. Ensaios TaqMan genotipagem, desenvolvido pela Life Technologies, pode executar um grande número de amostras de forma rápida e com o mínimo envolvimento técnico [2], mas as restrições SNP-multiplexação continuam a limitar o número total de genótipos para bem menos de um milhão por dia [3,4 ]. Plataforma Iplex da Sequenom também pode executar muitas amostras de uma só vez, mas, como menos de cem SNPs podem ser multiplexados em conjunto, o throughput é comparativamente baixa global [5]. Tecnologia fluxo SNP da Beckman Coulterpoderia, teoricamente, produzir mais de três milhões de genótipos por dia, mas esta faixa de limites de tecnologia de projeto para um máximo de apenas quarenta e oito SNPs por reação [4,6]. Enquanto o ensaio GoldenGate pode processar quase duas centenas de amostras de DNA de cada dia em centenas ou milhares de SNPs por amostra, o preço por genótipo não é competitivo com, técnicas avançadas de ultra-alto rendimento ao digitar mais de três mil SNPs de uma só vez [4,7 ]. A fim de processar vários milhões de genótipos por dia, a escala necessária para grandes estudos de associação do genoma, os ensaios matriz de hibridização tornaram-se a opção mais rentável no mercado.
Linha de Affymetrix de matrizes de hibridização e linha de matrizes à base de Infinium da Illumina permitir potencialmente centenas de amostras a ser digitado em centenas de milhares ou milhões de SNPs em paralelo [4,8]. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma, localizada em regiões de interesse, como a exomes, ou personalizado com a preferência do usuário. Estas matrizes têm a vantagem de não apenas ser capaz de genótipo com precisão um milhão de SNPs por amostra de uma vez, mas também para medir a variação do número de cópias, anormalidades cromossômicas potencialmente revelando. Infinium alinhados matrizes OMNI BeadChip atualmente tem a capacidade de genótipo até quase cinco milhões de marcadores por amostra, incluindo meio milhão de loci costume, em até cerca de cem amostras de cada dia.
Como a maioria das doenças têm um componente genético, essas experiências em larga escala pode ser crucial na busca de genes associados com a doença. De alta capacidade para a geração de genotipagem permite genótipo eficiente no exemplo define grande o suficiente para detectar de forma convincente de associação genética em freqüências alélicas menores inferiores. Projectos de genotipagem todo o genoma pode ser usado para localizar regiões com freqüência do alelo de caso-controle estatisticamente significativa ou diferenças no número de cópias [9,10,11]. De acordo com o National Human GeInstituto de Pesquisa de nome, estudos de associação ampla de genoma levou a 1.490 publicações separadas entre 25 de novembro de 2008 e 25 de janeiro de 2013, decorrente da descoberta de SNPs 8283 com um valor de p menor que 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Esses estudos, que pesquisou as condições que vão desde a altura ao câncer testicular, beneficiou da abordagem ampla proporcionada por uma análise de todo o genoma. Em casos como estes, regiões inteiras de interesse poderia ter escapado à atenção tinha o escopo de digitação sido demasiado restritiva. Assim, para análises de associação em grande escala, uma técnica de genotipagem de todo o genoma é a técnica de escolha.
Existem diferentes versões do ensaio Infinium, cada um projetado para uso com tipos específicos de arrays. O ensaio InfiniumUltra, discutidos em profundidade a seguir, é adequado para muitos 12 – ou lascas de matriz 24 de amostra. Estes, muitas vezes o genótipo mais de cem mil SNPs por amostra de DNA e se concentrar em targeted regiões, como em exome ou personalizados painéis. Outras versões do ensaio podem ser necessárias para outros tipos de chips, como as matrizes de genotipagem de todo o genoma. No entanto, como todos os ensaios Infinium compartilham uma base comum e diferem principalmente apenas pelos nomes de reagentes, os volumes de reagentes, ou o procedimento exato reagente coloração, técnicas aperfeiçoadas em uma versão ensaio muitas vezes pode ser universalmente aplicado. Outras matrizes, como matrizes de metilação, pode usar um protocolo quase idênticas, como bem. Cuidados devem ser tomados ao utilizar apenas a versão de ensaio necessários para o tipo de chip em uso. Alguns tipos, como as que medem nível de expressão de genes, pode exigir o uso de um protocolo de nonInfinium.
As amostras devem ser processadas em lotes. Por exemplo, com o ensaio de InfiniumUltra, tubos de ensaio de pré-hibridação conter um volume suficiente para executar 96 amostras, e os tubos não podem voltar a ser congelados. Portanto, as amostras devem ser executados em lotes de 96 amostras de cada vez. As amostras serão amplificados sobre os abetosdia t. Após aproximadamente 1 hora de benchwork, as amostras devem ser aquecidos num forno de convecção durante 20-24 hr. No dia seguinte, cerca de 4 horas, será gasto fragmentação, precipitação, e ressuspensão das amostras, no ponto em que as amostras podem ser congeladas para uso futuro ou hibridadas com o chip. Carregando fichas leva quase 2 horas, após o qual as amostras serão hibridizados durante a noite por 16-24 horas. No terceiro dia, o passo de coloração e extensão leva ~ 4 horas. Uma hora mais será gasto lavagem, revestimento, secagem e os chips. Finalmente, as matrizes são verificados, o que pode levar 15-60 min / chip, dependendo do tipo usado.
As precauções padrão de segurança de laboratório e limpeza aplicar. Embora a amplificação não é à base de RCP, as estações de trabalho separados para pré-e postamplification procedimentos são necessários a fim de minimizar a probabilidade de contaminação. O número de cada reagente fornecido pelo kit em uso de identificação deverá ser registrado em uma folha de rastreamento. Reagents devem ser descongeladas imediatamente antes da utilização e invertido várias vezes antes de dispensar. O DNA a ser digitado deve ser ADN genómico de alta qualidade (260/280 razão de absorvâncias de 1,6-2,0, 260/230 razão de absorvâncias de abaixo de 3,0), isolado através de métodos padrão e quantificados com um fluorómetro. Degradação de DNA é muitas vezes um fator que contribui para os resultados do ensaio de baixa qualidade. Normalmente, é necessária a 200 ng de ADN, embora esta quantidade pode variar de alguns tipos de chip. A-manipulação líquido Tecan robô pode automatizar muitas etapas do protocolo e minimizar o erro humano como um fator.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicações de genotipagem em larga escala têm sido usados para compreender melhor o mecanismo genético subjacente muitas doenças humanas. A descoberta de qualquer variante significativa através de uma análise de associação do genoma pode sinalizar uma região candidata para um estudo mais aprofundado. Além disso, os dados do genótipo é uma boa ferramenta para o controle de qualidade em projetos de seqüenciamento.
Para maximizar o rendimento da amostra, várias placas de amostra podem ser amplificados e armazenados em seus fragmentados, estados suspensão. Oito placas pode ser amplificado em um único dia, combinando a primeira 24 horas do protocolo para vários lotes e fornecer material suficiente para ~ 2-8 dias de processamento de chip. Se as placas são armazenadas previamente amplificados, e se novas amostras são cruzados para fichas imediatamente após a digitalização começa na corrida anterior, o processamento pode ser executado de forma contínua, sem a necessidade de fazer uma pausa para a preparação da amostra adicional. Portanto, apesar de amostras terá três dias para submeter-se ao completoensaio, os dados podem ser gerados por dia. Fichas Assuming24 são processados a cada dia, uma semana de trabalho de cinco dias permite a mais de um mil amostras de DNA para serem executados em um chip de talão de 12 amostras. Se um dos passos ou reagente falhou, no entanto, vários lotes pode estar em risco para o mau desempenho antes de qualquer correção pode ser aplicada. Os erros podem passar despercebidos até que as matrizes são digitalizados ou analisado, portanto, se o rendimento é maximizado, centenas de amostras em vários estágios do protocolo já poderia ter recebido o mesmo tratamento com defeito após o descobrimento. Como os reagentes e os dados perdidos não podem ser recuperados, o usuário deve pesar os riscos contra a necessidade de um fluxo de trabalho acelerado.
O software de análise de GenomeStudio é a primeira oportunidade de medir realmente o sucesso do processo de genotipagem. Se a Norma-R vs parcelas intensidade Norm-Teta estão devidamente agrupados, a taxa média de chamada (por cento do total de SNPs digitado com sucesso) das amostras deve se aproximar de 99%, embora este valor varia slightly dependendo do tipo de matriz. Os dados a partir de qualquer amostra com uma taxa de chamada menor que 85-90% não é confiável e deve ser descartada. Para fins de controle de qualidade, os resultados devem ser comparados a qualquer genótipos previamente conhecidos sempre que possível. Se esses dados não existe, intencional duplicação da amostra é uma ferramenta útil na verificação da placa ou matriz colocações. Estes pares duplicados devem ser colocados em chips separados, placas, lotes ou projectos; seus genótipos verificado após geração. Enquanto constrangimentos específicos QC variar de acordo com a preferência do investigador, as restrições comuns SNP são baseados em sucesso chamada de exemplo, o equilíbrio de Hardy-Weinberg, ou falta completa entre casos e controles, enquanto que as restrições de amostras comuns são baseados em taxas de chamada, inconsistências mendelianas, ou referências cruzadas do cromossomo X heterozygosity aos dados clínicos de gênero [13].
Se algum problema surge, o Dashboard Controles, encontrado na suíte de análise, podem ser submetidos àcompanhia, a fim de determinar a causa. Esses controles muitas vezes pode limitar o problema ao passo provável ou falha de reagentes. Se algum SNPs de interesse são encontrados através de um experimento genotipagem Infinium, suas parcelas de intensidade deve ser verificada em GenomeStudio por erros de agrupamento antes de mais pesquisas sejam efetuadas.
Um experimento de genotipagem Infinium não é provavelmente devido a um erro de processamento humano ou DNA entrada de má qualidade. Amostra quantificação deve ser exato e preciso. Para melhores resultados, os reagentes adicionados a qualquer amostra ou chip tem de ser vertido para o volume definido pelo protocolo. As pipetas devem ser devidamente calibrado. Os reagentes não devem ser executados após o vencimento e não devem ser novamente congelados, uma vez descongelado, para salvar o reagente RA1. A fim de minimizar possíveis erros de coloração e de extensão, a mistura de formamida / EDTA deve ser preparado todos os meses. Todos os -20 ° C reagentes devem ser armazenados em freezers apenas o manual-degelo. Todo material de laboratório usado na ruaaining, de extensão e de lavagem de partes do protocolo deve ser lavada cuidadosamente com água e detergente neutro imediatamente após desuso. Os reservatórios de umidificação na câmara hyb deve ser limpo com uma escova de tubo de ensaio e detergente neutro. As lâminas de vidro devem ser lavados com água sanitária a 10%, conforme as instruções dos seus manuais do usuário, uma vez por semana.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, e NIH R56 AI063274
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
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