Мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia на основе химического мутагенеза и секвенирование целого генома. Кроме того, система ДНК обмена в инфицированных клетках описано, что могут быть использованы для генетического картирования. Этот метод может быть широко применима к микробных системах без системы трансформации и молекулярно-генетические инструменты.
Хламидиоза, этиологическим агентом венерических заболеваний и глазных инфекций, остается слабо изучен из-за его несговорчивости экспериментальным преобразование с рекомбинантной ДНК. Мы разработали подход для выполнения генетического анализа в C. трахоматис несмотря на отсутствие молекулярно-генетических инструментов. Наши способ включает: а) химический мутагенез быстро генерировать подробные библиотеки генетически определенных мутантов с различными фенотипами; II) целого генома (ВГС) для отображения основных генетических повреждений и найти связь между мутировавший ген (ы).. общий фенотип. III) поколение рекомбинантных штаммов через ко-инфекции клеток млекопитающих с мутантным и диких бактерий типа. Соответственно, мы смогли установить причинно-следственные связи между генотипами и фенотипами. Сочетание химически индуцированного изменения генов и WGS установить корреляционные генотип-фенотип ассоциации ШоуLD быть широко применима к большой список медицинских и экологически значимых микроорганизмов в настоящее время неразрешимыми генетического анализа.
Облигатные внутриклеточные бактерии хламидиоза, по подсчетам, 2800000 половых путей в год в США (Центр по контролю за заболеваниями) с соответствующими последствиями, таких как воспалительные заболевания тазовых органов, внематочная беременность и бесплодие (1). Chlamydia SPP есть уникальная физиологию с двухфазной цикл развития, состоящий из двух формах: инфекционной болезнью, но нереплицирующейся элементарное тело (EB) и неинфекционной но репликативное сетчатые тела (РБ). Инфекция начинается с приложением ЭТ в эпителиальных клетках последующим endoctyotosis (2). В мембраной вакуоли называют включение ЭТ дифференцироваться в УБ формы, которая затем размножается делением. В середине цикла, RBS переходит обратно в EBS, которые выбрасываются в межклеточное пространство, чтобы инициировать новые раунды инфекции, когда клетки-хозяина лизирует (3).
Хламидийной являетсярефрактерных к обычной манипуляции со стандартными молекулярно-генетические инструменты, такие как замена целевого гена, транспозонов и трансдуцирующих фаги, которые занимали центральное место в большинстве исследований в генетике бактерий, неясно, в какой степени отдельные гены Chlamydia вклад в уклонении от врожденного иммунитета , питательные приобретение, развитие переходов или других процессов, важных для выживания патогена в эукариотических хоста (4). Следовательно, этот возбудитель остается слабо изучен, несмотря на клиническую значимость.
Генома Chlamydia SPP. относительно малы (~ 1 Mb) (5) с несколькими видами и биоваров секвенировали с использованием технологии следующего поколения секвенирования. Сравнительный анализ генома WGS предоставил уникальную информацию об эволюции хламидийной видов и их адаптации к человеку (6-8) и в некоторой степени оказывает определенную информацию в отношении потенциальной функции факторов вирулентности (9, 10). Tон генетическим разнообразием отображается клинических изолятов не обеспечивает требуемого разрешения систематически отобразить функцию большинство факторов вирулентности, предположительно из-за мутаций в таких генов было бы легко выбраны против. Не смешивая эффекты от естественного отбора, мутагенным индуцированные изменения гена, в сочетании с анализами, которые определены меры дефекты в вирулентности, может расширить спектр мутаций, которые могут обследоваться. Химические мутагены, в частности, являются полезными, поскольку они могут генерировать нулевой, условно, гипоморфных (снижение функции) и гиперморфный (усиление функции) аллелей. С приходом надежные следующего поколения секвенирования генома-технологии, такие мутации могут быть легко выявлены и нанесены на карту. Таким образом, сильные ассоциации может быть сделано между мутации в гене пути или генетических и общий фенотип, что позволяет применение вперед генетических методов.
Последовательности геномов клинических штаммов показало мозаицизмом Between сероваров и локусов часто рекомбинации (11). Эмпирические данные рекомбинации была продемонстрирована через ко-инфекцией двух различных устойчивых к антибиотикам штаммов и отбор устойчивых двойного рекомбинантного потомства, который был показан, чтобы генетические вклады от обоих штаммов (12, 13). Таким образом, генетический обмен между дикого типа и мутантных штаммов в ко-инфекции настройка позволяет сегрегации химически индуцированных мутаций, чтобы точно определить, что пострадавших гена приводит к наблюдаемым фенотип.
Здесь мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia основе химического мутагенеза, WGS, и система обмена в ДНК зараженных клеток (14) (рис. 1).
Данная методика отвечает основным требованиям для генетического анализа, как он устанавливает связь между генотипами и фенотипами. Важно отметить, что это достигается без помощи обычных молекулярных инструментов для преобразования рекомбинантный ДНК и инсерционной инактивации ген?…
The authors have nothing to disclose.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
1 M NaOH | |||
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
Water (sterile, tissue culture grade) | |||
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
Ethanol (molecular biology grade) | |||
8 mM NaOH | |||
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
6-well tissue culture plates | |||
12-well tissue culture plates | |||
96-well tissue culture plates | |||
Chemical safety hood | |||
Biological safety hood | |||
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
>Dissection microscope | |||
Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |