Summary

Вперед генетические подходы в<em> Хламидиоза</em

Published: October 23, 2013
doi:

Summary

Мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia на основе химического мутагенеза и секвенирование целого генома. Кроме того, система ДНК обмена в инфицированных клетках описано, что могут быть использованы для генетического картирования. Этот метод может быть широко применима к микробных системах без системы трансформации и молекулярно-генетические инструменты.

Abstract

Хламидиоза, этиологическим агентом венерических заболеваний и глазных инфекций, остается слабо изучен из-за его несговорчивости экспериментальным преобразование с рекомбинантной ДНК. Мы разработали подход для выполнения генетического анализа в C. трахоматис несмотря на отсутствие молекулярно-генетических инструментов. Наши способ включает: а) химический мутагенез быстро генерировать подробные библиотеки генетически определенных мутантов с различными фенотипами; II) целого генома (ВГС) для отображения основных генетических повреждений и найти связь между мутировавший ген (ы).. общий фенотип. III) поколение рекомбинантных штаммов через ко-инфекции клеток млекопитающих с мутантным и диких бактерий типа. Соответственно, мы смогли установить причинно-следственные связи между генотипами и фенотипами. Сочетание химически индуцированного изменения генов и WGS установить корреляционные генотип-фенотип ассоциации ШоуLD быть широко применима к большой список медицинских и экологически значимых микроорганизмов в настоящее время неразрешимыми генетического анализа.

Introduction

Облигатные внутриклеточные бактерии хламидиоза, по подсчетам, 2800000 половых путей в год в США (Центр по контролю за заболеваниями) с соответствующими последствиями, таких как воспалительные заболевания тазовых органов, внематочная беременность и бесплодие (1). Chlamydia SPP есть уникальная физиологию с двухфазной цикл развития, состоящий из двух формах: инфекционной болезнью, но нереплицирующейся элементарное тело (EB) и неинфекционной но репликативное сетчатые тела (РБ). Инфекция начинается с приложением ЭТ в эпителиальных клетках последующим endoctyotosis (2). В мембраной вакуоли называют включение ЭТ дифференцироваться в УБ формы, которая затем размножается делением. В середине цикла, RBS переходит обратно в EBS, которые выбрасываются в межклеточное пространство, чтобы инициировать новые раунды инфекции, когда клетки-хозяина лизирует (3).

Хламидийной являетсярефрактерных к обычной манипуляции со стандартными молекулярно-генетические инструменты, такие как замена целевого гена, транспозонов и трансдуцирующих фаги, которые занимали центральное место в большинстве исследований в генетике бактерий, неясно, в какой степени отдельные гены Chlamydia вклад в уклонении от врожденного иммунитета , питательные приобретение, развитие переходов или других процессов, важных для выживания патогена в эукариотических хоста (4). Следовательно, этот возбудитель остается слабо изучен, несмотря на клиническую значимость.

Генома Chlamydia SPP. относительно малы (~ 1 Mb) (5) с несколькими видами и биоваров секвенировали с использованием технологии следующего поколения секвенирования. Сравнительный анализ генома WGS предоставил уникальную информацию об эволюции хламидийной видов и их адаптации к человеку (6-8) и в некоторой степени оказывает определенную информацию в отношении потенциальной функции факторов вирулентности (9, 10). Tон генетическим разнообразием отображается клинических изолятов не обеспечивает требуемого разрешения систематически отобразить функцию большинство факторов вирулентности, предположительно из-за мутаций в таких генов было бы легко выбраны против. Не смешивая эффекты от естественного отбора, мутагенным индуцированные изменения гена, в сочетании с анализами, которые определены меры дефекты в вирулентности, может расширить спектр мутаций, которые могут обследоваться. Химические мутагены, в частности, являются полезными, поскольку они могут генерировать нулевой, условно, гипоморфных (снижение функции) и гиперморфный (усиление функции) аллелей. С приходом надежные следующего поколения секвенирования генома-технологии, такие мутации могут быть легко выявлены и нанесены на карту. Таким образом, сильные ассоциации может быть сделано между мутации в гене пути или генетических и общий фенотип, что позволяет применение вперед генетических методов.

Последовательности геномов клинических штаммов показало мозаицизмом Between сероваров и локусов часто рекомбинации (11). Эмпирические данные рекомбинации была продемонстрирована через ко-инфекцией двух различных устойчивых к антибиотикам штаммов и отбор устойчивых двойного рекомбинантного потомства, который был показан, чтобы генетические вклады от обоих штаммов (12, 13). Таким образом, генетический обмен между дикого типа и мутантных штаммов в ко-инфекции настройка позволяет сегрегации химически индуцированных мутаций, чтобы точно определить, что пострадавших гена приводит к наблюдаемым фенотип.

Здесь мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia основе химического мутагенеза, WGS, и система обмена в ДНК зараженных клеток (14) (рис. 1).

Protocol

1. Химического мутагенеза Примечание: Мы обнаружили, что форма репликативное РБ является более пригодным для химического мутагенеза, чем EB форме. В середине цикла (от 18 до 20 HPI), RBS находятся в наибольшем количестве до RB-EB перехода. Поскольку хламидиоза является облигат…

Representative Results

Воздействие мутаген приводит к включений, которые появляются лишенной бактерий, предположительно из-за бактериальной клеточной смерти. Как правило, серовар LGV-L2 полностью лизировать инфицированные клетки в течение 48 ч после заражения, но лечение с мутагенов может продлить этот цикл>…

Discussion

Данная методика отвечает основным требованиям для генетического анализа, как он устанавливает связь между генотипами и фенотипами. Важно отметить, что это достигается без помощи обычных молекулярных инструментов для преобразования рекомбинантный ДНК и инсерционной инактивации ген?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS) Sigma M0880
Cyclohexamide Sigma C4859-1ML
Gentamicin Life Technologies 15750-060
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) Life Technologies 14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate Sigma D7777
Nonessential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved Lonzo 50070
Genomic DNA purification kits Qiagen 69504
DNAzol Life Technologies 10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit) Invitrogen Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument Covaris

References

  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
  3. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
  4. Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
  5. Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
  6. Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
  7. Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
  8. Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
  9. Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
  10. Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
  11. Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
  12. DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
  13. Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
  14. Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  15. Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
  16. Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
  17. Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
  18. Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
  19. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  20. Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
  21. Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
  22. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (80), e50636, doi:10.3791/50636 (2013).

View Video