Summary

フォワード遺伝的アプローチで<em>クラミジアトラコマチス</em

Published: October 23, 2013
doi:

Summary

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。

Abstract

クラミジアトラコマチス 、性病と眼感染症の病原体は、組換えDNAで不完全に起因する実験的な変革へのその扱いにくさに特徴のままです。我々はCで遺伝子解析を実行するためのアプローチを開発分子遺伝学的ツールの不足にもかかわらず、 トラコマティス 。我々の方法は、関係する:i)急速に明確な表現型と遺伝的に定義された変異体の包括的なライブラリを生成するために、化学的突然変異誘発し、ii)の全ゲノムシーケンシング(WGS)は、基礎となる遺伝的病変をマッピングすると、変異遺伝子(群)との間の関連を見つけると。共通の表現型; iii)の変異体および野生型細菌と哺乳動物細胞の同時感染を介した組換え株の生成。そこで、遺伝子型と表現型の間の因果関係を確立することができました。相関遺伝子型 – 表現型の関連百鬼夜行を確立するために、化学的に誘発される遺伝子変異とWGSのカップリングldは遺伝子解析に現在難病医学的に、環境に重要な微生物の大規模なリストに広く適用される。

Introduction

関連付けられていると、米国では年間推定280万生殖路感染症(疾病管理センター)の後遺症などの骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、および不妊症(1)などのための絶対細胞内細菌のクラミジアトラコマチスアカウントクラミジア属はユニークを持っている感染が、非複製素体(EB)と非感染性はなく複製網状体(RB):2つの形式で構成される二相性発達サイクルで生理。感染endoctyotosis(2)続いて上皮細胞へのEBのアタッチメントから始まります。膜結合液胞は、インクルージョンと呼ばれる中では、EBをその後二分裂によって複製RB形、に分化する。半ばサイクルで、RBの遷移当時感染の新しいラウンドを開始するために、細胞外空間に放出されているEBを、ときに宿主細胞溶解する(3)。

クラミジアですこのような細菌の遺伝学のほとんどの研究の中心となっている標的遺伝子の交換、トランスポゾン、および形質導入ファージ、などの標準的な分子遺伝学的ツールを使用してルーチン操作に耐火、それは個々のクラミジア遺伝子が自然免疫の回避に寄与する程度は不明である、栄養買収、発達トランジション、または真核生物宿主(4)内の病原体の生存のために重要な他のプロセス。したがって、この病原体はその臨床的重要性にもかかわらず、不十分な特徴のままです。

クラミジア属のゲノム。次世代シーケンシング技術を用いて配列決定、複数の種と生物型に(5)(〜1 MB)比較的小さい。 WGSによって比較ゲノム解析クラミジア種の進化にユニークな洞察を提供しており、ヒトの(6-8)へとある程度彼らの適応は病原因子のポテンシャル関数(9、10)のようないくつかの情報を提供してきました。 T臨床分離株で表示される、彼の遺伝的多様性は、このような遺伝子の変異を容易に対して選択されていたので、おそらく、体系的にほとんどの病原因子の機能をマッピングするために必要な解像度を提供していません。自然淘汰から交絡影響を与えることなく、病原性のメジャー欠陥その定義されたアッセイと相まって変異誘発の遺伝子変化は、調査することができる突然変異のスペクトルを拡張することができます。化学変異原は、特に、それらがnull、条件、hypomorphic(機能低下)を生成することができますとして有用、とhypermorphic(関数のゲイン)対立遺伝子である。堅牢な次世代のゲノム配列決定技術の到来により、そのような変異を容易に識別してマッピングすることができる。このように、強いアソシエーションが前方に遺伝的アプローチの適用を可能にする、遺伝子または遺伝子経路の変異および共通の表現型の間で行うことができる。

臨床株のゲノム配列は、モザイクBを明らかにしたetweenの血清型と頻繁な組み換えの軌跡(11)。組換えの経験的証拠は、2つの異なる抗生物質耐性株の両方株(12,13)からの遺伝的寄与を有することが判明した二重耐性子孫組換えの選択の同時感染により実証した。したがって、同時感染設定で野生型と変異株の間で遺伝子交換は、化学的に誘発される突然変異の偏析が観察された表現型につながる影響を受けた遺伝子を特定することができます。

ここでは、化学的突然変異誘発、WGS、および感染細胞内のDNA交換(14)( 図1)のためのシステムに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。

Protocol

1。化学変異注意:我々は、複製RBフォームはEBフォームより化学的突然変異誘発をより従順であることがわかった。半ばサイクル(HPI 20から18の間)で、RBは、事前RB-EB遷移の最大の数字である。 クラミジアは偏性細胞内の病原体であるため、ホストの健全性に対する変異の効果は、細菌の回復を制限することができます。ベロ細胞は、試験した他の細胞株に比べEMS?…

Representative Results

突然変異原への曝露は、細菌の細胞死が原因おそらく、細菌を欠い現れる介在物につながる。一般的に、血清型LGV-L2は完全に48時間後に感染症の中で感染した細胞を溶解しますが、変異誘発物質による治療は> 90 hまでこのサイクルを拡張することができます。介在物の約10%が回復すると予想される。我々の実験では、20 mg / mlのEMSで治療感染Vero細胞は、未処理のコントロールと比較して感?…

Discussion

それは遺伝子型と表現型の間のリンケージを確立するように、この方法論は、遺伝子解析のための基本的な要件を満たしています。重要なことに、これはしばしば、非モデル微生物における遺伝子機能の解析における律速段階である組換えDNA形質転換菌の遺伝子の挿入不活化のための従来の分子生物学のツールの助けを借りずに達成される。

一つの重要なステップは、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS) Sigma M0880
Cyclohexamide Sigma C4859-1ML
Gentamicin Life Technologies 15750-060
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) Life Technologies 14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate Sigma D7777
Nonessential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved Lonzo 50070
Genomic DNA purification kits Qiagen 69504
DNAzol Life Technologies 10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit) Invitrogen Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument Covaris

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Cite This Article
Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (80), e50636, doi:10.3791/50636 (2013).

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