Summary

Approches avant génétiques dans<em> Chlamydia trachomatis</em

Published: October 23, 2013
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Summary

Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.

Abstract

Chlamydia trachomatis, l'agent étiologique des maladies sexuellement transmissibles et les infections oculaires, reste mal caractérisée par son indocilité à la transformation expérimentale avec de l'ADN recombinant. Nous avons développé une approche pour effectuer l'analyse génétique de C. trachomatis malgré l'absence d'outils de génétique moléculaire. Notre méthode consiste à: i) la mutagenèse chimique pour générer rapidement des bibliothèques complètes de mutants génétiquement définis avec des phénotypes distincts; ii) séquençage du génome entier (WGS) pour cartographier les lésions génétiques sous-jacents et de trouver des associations entre gène muté (s) et.. un phénotype commun;. iii) la production de souches recombinantes à travers la co-infection de cellules de mammifères par des bactéries de type mutant et sauvage. En conséquence, nous avons pu établir des relations causales entre les génotypes et les phénotypes. Le couplage de variation génique induite chimiquement et WGS de créer des associations génotype-phénotype corrélatives should être largement applicable à la grande liste des micro-organismes médicalement et écologiquement importantes actuellement insolubles à l'analyse génétique.

Introduction

Les intracellulaire obligatoire bactérie Chlamydia comptes trachomatis pour environ 2,8 millions d'infections génitales des voies par an aux Etats-Unis (Center for Disease Control) avec associé séquelles telles que la maladie inflammatoire pelvienne, des grossesses ectopiques et l'infertilité (1). Chlamydia spp ont une occasion unique physiologie d'un cycle de développement biphasique consistant en deux formes: le corps élémentaire infectieux mais non répliquant (EB) et le corps réticulé non infectieux mais réplicatif (RB). L'infection commence par la fixation d'EBS aux cellules épithéliales suivies endoctyotosis (2). Au sein d'une vacuole membranaire appelé une inclusion, EBS se différencier en forme RB, qui reproduit ensuite par scissiparité. Au milieu de cycle, les transitions RBS retour dans EBS, qui sont ensuite expulsés dans l'espace extracellulaire pour initier de nouveaux cycles d'infection lors de la lyse de la cellule hôte (3).

C. trachomatis estréfractaires à une manipulation de routine avec des outils de génétique moléculaire standard, telles que le remplacement ciblé de gènes, transposons, et les phages transducteurs, qui ont été au centre de la plupart des études en génétique bactérienne, on ne sait dans quelle mesure les gènes de Chlamydia individuels contribuent à l'évasion de l'immunité innée , l'acquisition des éléments nutritifs, transitions développementales, ou d'autres processus importants pour la survie de l'agent pathogène dans un hôte eucaryote (4). Par conséquent, cet agent pathogène reste mal caractérisée, malgré son importance clinique.

Les génomes de Chlamydia spp. sont relativement faibles (~ 1 Mb) (5) avec de multiples espèces et biovars séquencés en utilisant des technologies de séquençage de prochaine génération. Analyse comparative du génome par WGS a fourni un aperçu unique dans l'évolution des espèces Chlamydia et leur adaptation à l'homme (6-8) et dans une certaine mesure, a fourni quelques informations sur la fonction potentielle de facteurs de virulence (9, 10). TIl diversité génétique affichée par les isolats cliniques ne fournit pas la résolution requise pour cartographier systématiquement la fonction de la plupart des facteurs de virulence, sans doute parce que des mutations dans ces gènes auraient été facilement sélectionné contre. Sans effets confondants de la sélection naturelle, la variation du gène mutagène induit, couplée à des tests définis qui permettent de mesurer les défauts de virulence, peuvent étendre le spectre des mutations qui peuvent être interrogés. Mutagènes chimiques, en particulier, sont utiles car ils peuvent générer nulle conditionnelle hypomorphic (fonction réduite), et hypermorphic (gain de fonction) allèles. Avec l'arrivée des technologies de séquençage des génomes robustes de la prochaine génération, telles mutations peuvent être facilement identifiés et cartographiés. De cette manière, les associations fortes peuvent être faites entre des mutations dans un gène ou voie génétique et le phénotype commun, permettant l'application d'approches avant génétiques.

Les séquences du génome des souches cliniques ont révélé mosaïque bntre les sérotypes et les lieux de recombinaison fréquente (11). Les données empiriques de recombinaison a été démontré par la co-infection de deux souches résistantes aux antibiotiques différents et le choix de la double descendance recombinante résistant, qui a été révélé à avoir des contributions génétiques de deux souches (12, 13). Ainsi, l'échange génétique entre les souches de type sauvage et mutants dans un milieu de co-infection permet la séparation des mutations induites chimiquement de localiser le gène concerné qui conduit au phénotype observé.

Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique, WGS, et un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées (14) (figure 1).

Protocol

1. Mutagenèse chimique Note: Nous avons constaté que la forme de RB réplicative est plus propice à la mutagenèse chimique que le formulaire de EB. Au milieu de cycle (entre 18 à 20 HPI), RBS sont au plus grand nombre avant la transition RB-EB. Parce que Chlamydia trachomatis est un pathogène intracellulaire obligatoire, les effets de l'agent mutagène sur la santé de l'hôte peut limiter la récupération bactérienne. Des cellules Vero ont été trouvés à être plus…

Representative Results

L'exposition aux substances mutagènes conduit à inclusions qui semblent dépourvues de bactéries, probablement en raison de la mort de la cellule bactérienne. Typiquement, le sérotype LGV-L2 sera complètement lyse des cellules infectées dans les 48 heures après l'infection, mais le traitement avec mutagènes peut prolonger ce cycle> 90 h. Environ 10% des inclusions devraient se redresser. Dans nos expériences, les cellules Vero infectées traitées avec 20 mg / ml EMS a entraîné une diminution de 9…

Discussion

Cette méthodologie répond aux exigences de base pour l'analyse génétique, car elle établit lien entre les génotypes et les phénotypes. Surtout, ce résultat est obtenu sans l'aide d'outils moléculaires classiques pour la transformation de l'ADN recombinant et inactivation par insertion de gènes dans des bactéries, ce qui est souvent une étape limitante dans l'analyse de la fonction des gènes dans les microbes non-modèles.

Une étape essentielle est d'assu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS) Sigma M0880
Cyclohexamide Sigma C4859-1ML
Gentamicin Life Technologies 15750-060
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) Life Technologies 14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate Sigma D7777
Nonessential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved Lonzo 50070
Genomic DNA purification kits Qiagen 69504
DNAzol Life Technologies 10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit) Invitrogen Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument Covaris

References

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Cite This Article
Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (80), e50636, doi:10.3791/50636 (2013).

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