Forward Genetische technieken in<em> Chlamydia trachomatis</em

De obligaat intracellulaire bacterie Chlamydia trachomatis is goed voor een geschatte 2,8 miljoen genitale infecties per jaar in de Verenigde Staten (Center for Disease Control) met bijbehorende complicaties zoals bekken ontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschappen en onvruchtbaarheid (1). Chlamydia spp hebben een unieke fysiologie met een bifasische ontwikkelingscyclus uit twee vormen: de infectieuze maar niet replicerende elementaire lichaam (EB) en infectueuze maar replicatieve netvormige body (RB). Infectie begint met de bevestiging van EBS aan epitheelcellen endoctyotosis gevolgd door (2). Binnen een membraangebonden vacuole genoemd een opname, EBS differentiëren in de RB vorm, die vervolgens repliceert door binaire splijting. Halverwege de cyclus, RBS overgangen terug in EBS, die vervolgens worden uitgestoten in de extracellulaire ruimte om nieuwe serie infecties teweeg wanneer de gastheercel lyses (3).

C. trachomatis isongevoelig routine manipulatie met standaard moleculaire genetische hulpmiddelen, zoals gerichte genvervanging, transposons en transducerende fagen, die centraal in de meeste studies in bacteriële genetica hebben, is onduidelijk welke mate individuele Chlamydia genen in het ontduiken van aangeboren immuniteit , nutriënten verwerving, ontwikkelings overgangen of andere processen van belang voor het overleven van de ziekteverwekker in een eukaryotische gastheer (4). Bijgevolg is deze ziekteverwekker blijft slecht gekarakteriseerd ondanks zijn klinisch belang.

De genomen van Chlamydia spp. zijn relatief klein (~ 1 Mb) (5) met meerdere soorten en biovars gesequenced met behulp van Next Generation sequencing technologieën. Vergelijkende genoomanalyse door WGS heeft een uniek inzicht in de evolutie van Chlamydia species en hun aanpassing aan de mens (6-8) en tot op zekere hoogte heeft enige informatie verstrekt over de mogelijke functie van virulentiefactoren (9, 10). THij genetische diversiteit weergegeven door klinische isolaten niet voorziet de resolutie die nodig is om systematisch in kaart de functie van de meeste virulentiefactoren, vermoedelijk omdat mutaties in dergelijke genen zou zijn gemakkelijk geselecteerd tegen. Zonder verstorende effecten van natuurlijke selectie, mutageen-geïnduceerde gen variant, in combinatie met gedefinieerde assays die maatregel defecten in virulentie, kan het spectrum van mutaties die kunnen worden onderzocht breiden. Chemische mutagenen, in het bijzonder, zijn nuttig als ze null, voorwaardelijke, hypomorphic (verminderde functie) te genereren en hypermorphic (gain of function) allelen. Met de komst van robuuste volgende generatie genoom-sequencing technologieën, kunnen dergelijke mutaties gemakkelijk worden geïdentificeerd en in kaart gebracht. Op deze wijze kan worden sterke associaties tussen veranderingen in een gen of genetische weg en een gemeenschappelijk fenotype, waardoor de toepassing van voorwaartse genetische methoden.

Het genoom sequenties van klinische stammen geopenbaard mosaicism bussen serovars en loci van frequente recombinatie (11). Empirisch bewijs voor recombinatie werd aangetoond door de co-infectie van twee verschillende antibiotica resistente stammen en selectie van dual resistente recombinant nageslacht, die werd geopenbaard aan genetische bijdragen van beide stammen (12, 13) hebben. Aldus genetische uitwisseling tussen wild type en mutante stammen in een co-infectie instelling maakt scheiding van chemisch-geïnduceerde mutaties op te sporen het aangetaste gen dat leidt tot de waargenomen fenotype.

Hier beschrijven we een werkwijze voor genetische analyse Chlamydia basis van chemische mutagenese, WGS en een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen (14) (fig. 1) uitvoeren.