النهج الوراثية إلى الأمام في<em> الكلاميديا المتدثرة</em
Summary
نحن تصف منهجية لإجراء تحليل وراثي في الكلاميديا يعتمد على الطفرات الكيميائية وكامل تسلسل الجينوم. وبالإضافة إلى ذلك، يوصف نظام لتبادل الحمض النووي داخل الخلايا المصابة التي يمكن استخدامها لرسم الخرائط الوراثية. قد تكون هذه الطريقة المطبقة على نطاق واسع لأنظمة الميكروبية التي تفتقر إلى نظم التحول والأدوات الوراثية الجزيئية.
Abstract
الكلاميديا، العامل المسبب للمرض من الأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي والتهابات العين، لا تزال تتسم سيئة بسبب استعصاء الرامية إلى التحول التجريبية مع الحمض النووي المؤتلف. وضعنا نهجا لإجراء تحليل وراثي في C. المتدثرة على الرغم من عدم وجود الأدوات الوراثية الجزيئية. ينطوي على طريقتنا: أنا) الطفرات الكيميائية لتوليد بسرعة مكتبات شاملة من المسوخ وراثيا محددة مع الظواهر متميزة؛ الثاني) كامل تسلسل الجينوم (WGS) لتعيين الآفات الوراثية الكامنة وإيجاد الارتباط بين الجين المتحور (ق) و. النمط الظاهري المشتركة؛ الثالث) توليد سلالات المؤتلف من خلال المشاركة في إصابة خلايا الثدييات مع البكتيريا نوع متحولة والبرية. وفقا لذلك، كنا قادرين على إقامة علاقات سببية بين الأنماط الجينية والظواهر. اقتران كيميائيا التي يسببها اختلاف الجينات والفريق العامل المعني بالحالات في إنشاء جمعيات الوراثي، النمط الظاهري المتلازم شوتكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع LD إلى قائمة كبيرة من الكائنات الحية الدقيقة طبيا وبيئيا هاما المستعصية حاليا للتحليل الجيني.
Introduction
وتلزم بين الخلايا بكتيريا الكلاميديا حسابات لما يقدر بنحو 2.8 مليون التهابات المسالك التناسلية سنويا في الولايات المتحدة (مركز السيطرة على الأمراض) مع عقابيل المرتبطة بها مثل مرض التهاب الحوض، والحمل خارج الرحم، والعقم (1). الكلاميديا SPP دينا فريدة من نوعها علم وظائف الأعضاء مع دورة التنموية ثنائي الطور تتكون من شكلين: الجسم الابتدائية المعدية ولكن غير المتماثل (EB) والجسم شبكي غير المعدية ولكن تنسخي (RB). تبدأ العدوى مع المرفق من EBS إلى الخلايا الظهارية تليها endoctyotosis (2). ضمن يطلق عليه فجوة غشاء محدد إدراج، EBS تفرق في شكل RB، الذي يعيد ثم بواسطة الانشطار الثنائي. في منتصف الدورة، والتحولات المكاتب الإقليمية مرة أخرى إلى EBS، التي يتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية لبدء جولات جديدة من حالات العدوى عند lyses الخلية المضيفة (3).
C. المتدثرة هوصهر للتلاعب الروتينية مع الأدوات الوراثية الجزيئية القياسية، مثل استبدال الجينات المستهدفة، الترانسبوزونات وفاجات transducing، والتي كانت محور معظم الدراسات في مجال علم الوراثة البكتيرية، وليس من الواضح إلى أي مدى تسهم جينات الكلاميديا الفرد إلى التهرب من المناعة الفطرية ، واقتناء المواد الغذائية، والتحولات التنموية، أو غيرها من العمليات الهامة لبقاء الممرض ضمن مجموعة حقيقية النواة (4). وبناء على ذلك، لا يزال هذا الممرض تتميز سيئة على الرغم من أهميتها السريرية.
جينوم الكلاميديا النيابة. هي صغيرة نسبيا (~ 1 ميغابايت) (5) مع أنواع متعددة ومتسلسلة biovars باستخدام تقنيات التسلسل التالي جيل. وقد وفرت تحليل الجينوم المقارن من قبل الفريق العامل المعني بالحالات رؤى فريدة حول تطور الأنواع الناجمة عن المتدثرة وتكيفها مع البشر (6-8) وإلى حد ما وقد وفرت بعض المعلومات عن وظيفة المحتملة للعوامل الفوعة (9، 10). Tكان التنوع الجيني المعروضة بواسطة العزلات السريرية لا يوفر القرار اللازم لتعيين منهجي وظيفة معظم عوامل الفوعة، ربما لأن الطفرات في هذه الجينات قد تم اختيارها بسهولة ضد. دون آثار الخلط من الانتقاء الطبيعي، المغير الناجم عن اختلاف الجينات، إلى جانب فحوصات محددة أن العيوب التدبير في الفوعة، يمكن توسيع الطيف من الطفرات التي يمكن شملها الاستطلاع. المطفرة الكيميائية، على وجه الخصوص، هي مفيدة لأنها يمكن أن تولد فارغة، مشروط، hypomorphic (وظيفة انخفاض)، وhypermorphic (كسب وظيفة) الأليلات. مع وصول تكنولوجيات الجينوم التسلسل قوية من الجيل التالي، مثل هذه الطفرات يمكن تحديدها بسهولة وتعيينها. بهذه الطريقة، يمكن جعل جمعيات قوية بين طفرات في الجينات الوراثية أو مسار والنمط الظاهري شيوعا، وتمكن من تطبيق النهج الوراثية إلى الأمام.
تسلسل جينوم سلالات السريرية كشفت الاصباغ بserovars إلى صف ومواضع من إعادة التركيب المتكرر (11). وقد تجلى الأدلة التجريبية من إعادة التركيب من خلال الرئيسين إصابة اثنين من مختلف السلالات المقاومة للمضادات الحيوية واختيار مزدوج ذرية المؤتلف مقاومة، الذي أنزل على ديها مساهمات الجينية من كلتا السلالتين (12، 13). وهكذا فإن التبادل الجيني بين نوع البرية وسلالات متحولة في إعداد العدوى المشتركة يسمح الفصل بين الطفرات التي يسببها كيميائيا لتحديد الجينات المتضررة أن يؤدي إلى النمط الظاهري المرصودة.
نحن هنا وصف منهجية لإجراء تحليل وراثي في الكلاميديا يعتمد على الطفرات الكيميائية، الفريق العامل المعني بالحالات، ونظام لتبادل الحمض النووي داخل الخلايا المصابة (14) (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه المنهجية يلبي المتطلبات الأساسية للتحليل الجيني كما أنها تضع الربط بين الأنماط الجينية والظواهر. الأهم من ذلك، ويتحقق هذا بدون مساعدة من الأدوات الجزيئية التقليدية للتحول الحمض النووي المؤتلف وتعطيل غرزي من الجينات في البكتيريا، والتي غالبا ما يكون معدل الحد خ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
