JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
français

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l'ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Published: October 18, 2014
doi:
10.3791/50607
, , , , , , ,
1Department of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology,Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering,University of Minnesota

Summary

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

Abstract

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Introduction

L'électrophorèse sur gel de cellule unique (SCGE) test (aka le test des comètes) est une technique largement utilisée pour la quantification d'un large spectre de lésions de l'ADN, y compris les lésions de base, les sites abasiques, cassures simple brin, des cassures double brin, des liaisons transversales et alcali sensible sites. Le principe sous-jacent de l'essai est que l'ADN endommagé migre plus facilement que l'ADN endommagé en raison de la fragmentation et de la perte de la structure superhélicoïdale. L'étendue de la migration est proportionnelle à la quantité de lésions de l'ADN, et peut être visualisée en utilisant la microscopie de fluorescence. Capture d'image et l'analyse du profil d'intensité de l'ADN en forme de comète individuel offrent alors des mesures de paramètres tels que la longueur de la queue, la queue moment, et l'ADN% en queue de révéler le niveau de dommages à l'ADN dans une cellule 1-4.

Actuellement, il existe deux versions couramment utilisées de l'essai de comète: a) test comète alcaline et b) dosage comète neutre. Le test des comètes alcalin est le plus largementversion utilisée, qui utilise un tampon à pH élevé pour se détendre avant électrophorèse ADN et donc détecte tous les types de cassures de brins et des sites sensibles aux alcalis. Le test des comètes neutre, d'autre part, est inférieur pratiqué car il utilise un tampon neutre à maintenir les hélices doubles et de détecter seulement des cassures double brin de 2,5. Pour les agents chimiques et physiques qui induisent CDB, BSN sont créés de concert, et sont formés à des niveaux beaucoup plus élevés (par exemple, BSN γIR-induites sont un ordre de grandeur plus commun que CDB). Pour la plupart des expositions endommageant l'ADN, CSD sont beaucoup moins fréquentes que les autres catégories de dommages de l'ADN, et sont donc plus difficiles à détecter. Nous avons démontré dans des publications antérieures de la fenêtre de détection de deux versions 6,7.

Bien que le test des comètes a été régulièrement utilisé pour la recherche fondamentale sur les lésions de l'ADN et la réparation et de la génotoxicité des tests 1,2,8-15, le test a été déclaré avoir une mauvaise reproductibilité de l'échantillon à-to-échantillon, de personne à personne et de la variabilité du laboratoire à la laboratoire. En outre, le dosage est faible débit, en partie parce que l'acquisition d'images et l'analyse de données sont laborieux. Ensemble, ces limitations contribuent à son acceptation relativement faible dans les études à grande échelle. Grâce à l'intégration de technologies et de principes d'ingénierie, la CometChip apporte une solution aux problèmes de débit et les incohérences qui sont associés à l'essai de comète traditionnelle 6,7. En bref, pour créer la puce, un moule est microfabriqué en utilisant la photolithographie pour créer des micro-messages ayant des diamètres aussi petits que celui d'une cellule unique. Le moule est ensuite utilisé pour emboutir sur agarose fondu, résultant en une matrice de micro-puits après la solidification du gel. Les puces sont développées pour fournir aux chercheurs des puits de taille variable pour compatible avec différents types de cellules. Pour charger la puce, les cellules dans les médias sont autorisés à s'installer dans les puits de gravité; les cellules excédentaires sont emportés. Cellules piégés sont ensuite encapsulés nousment une mince couche de bas point de fusion d'agarose, et une plaque de 96 puits sans fond est ensuite serré à la surface du gel de créer 96 macrowells, chacune avec des centaines de micro-puits sur sa surface inférieure.

Ce protocole décrit les procédures générales pour les expériences avec cette puce, qui comprennent la préparation du gel, la cellule de chargement, de dosage et de réparation, la lyse des cellules, l'électrophorèse, et l'imagerie de fluorescence. Nous démontrons deux exemples d'expériences de dose-réponse avec des cellules lymphoblastiques exposées agents endommageant l'ADN connu, en utilisant des versions neutres et alcalins de l'essai, respectivement. Deux expériences de réparation sont également présentés pour décrire comment la réponse de réparation post-exposition peut être évaluée à l'aide du système.

Protocol

1 Préparation de puce Retirer le gel de la puce de son emballage et placez dans un côté du film d'un seul puits plaque rectangulaire, gel vers le bas. Laver gel dans 25 ml 1x PBS pendant 15 min, répéter deux fois. Réglez gel sur plaque de verre et l'étiquette orientation de gel en conséquence. Appuyez doucement sur une plaque de 96 puits sans fond inversé sur le gel; assurez-vous que tous les puits de la plaque de puits sans fond sont dans la zone du gel. Utiliser 1,5 '' des clips liants sur chaque côté de la plaque de serrage pour fixer avec le verre. Aspirer excès tampon PBS dans chaque puits. 2. cellules de chargement Préparer des suspensions cellulaires: Pour les lignées cellulaires en suspension, diluer la suspension de cellules dans un milieu pour obtenir une concentration finale de 10 5 -10 6 cellules / ml. Pour les lignées cellulaires adhérentes, suivre les protocoles normaux de séparation / trypsinisation et dILUTE cellules détachées dans un milieu à une concentration finale de 10 5 -10 6 cellules / ml. Si les cellules s'agrègent, passer suspension de cellules dans un filtre cellulaire pour obtenir une suspension de cellules isolées. Ajouter 100 ul de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Couvrir la plaque avec le film de gel pour éviter l'évaporation des médias. Permettent aux cellules de charge pendant au moins 30 min à 37 ° C incubateur. Retirer puce de médias de l'incubateur et aspirer chaque puits. Retirer des clips liant et plaque de 96 puits sans fond; tenir la puce avec la plaque de verre à un angle et rincer doucement avec 1x PBS pour éliminer les cellules excédentaires sur agarose. Vérifiez cellule chargement à l'aide d'un microscope à champ lumineux avec un objectif 4X. Si le chargement insuffisante est observée, recommencer depuis l'étape 2.1. Placez puce chargée sur une surface plane (table de laboratoire). Puce superposition avec 1% à bas point de fusion (LMP) agarose qui est pré-chauffé à 37 ° C. Utiliser environ 2̵1, 3 ml d'agarose LMP est nécessaire pour chaque puce. Laisser recouvrement se solidifier abord à température ambiante pendant 3 min, puis passer à 4 ° C réfrigérateur pendant 5 min pour la gélification complète. 3. de dosage et de réparation REMARQUE: Pour étudier base du niveau de dommages à l'ADN, passez à l'étape 4. Aligner soigneusement les puits de la puce (créé à partir de serrage précédent) avec les puits d'une nouvelle plaque de 96 puits sans fond. Re-appuyez sur la plaque de 96 puits sans fond sur serrage supérieure et sécurisé avec des clips de liant. Ajouter 100 ul de dose souhaitée de produit chimique dans chaque puits de la plaque à 96 puits; réaliser le dosage / traitement sur de la glace ou à 4 ° C pour réfrigérateur quantité désirée de temps. Après le dosage, les produits chimiques aspirer de chaque puits et rincer les résidus chimiques utilisant 1x PBS. Si les dommages directs sont étudiés ici, passez à l'étape 4. Pour étudier la cinétique de réparation, permettre aux cellules dans la puce de réparer enmédias à 37 ° C. Lyse (passez à l'étape 4) à des moments spécifiques. REMARQUE: La réparation peut être effectuée sur la puce avec une plaque 96 puits sans fond attachée, ou de la puce peut être découpée en morceaux séparés après le retrait de la plaque à 96 puits sans fond. 4. Lysis Pour effectuer test des comètes alcaline: Faire de travail du tampon de lyse alcaline par addition de 1% de Triton X-100 à la lyse alcaline solution mère (2,5 M de NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM de Tris, pH 10). Préparer environ 25 ml de travailler tampon de lyse pour chaque puce. Pré-froid travailler tampon de lyse alcaline à 4 ° C. Immerger puce dans un tampon de lyse alcaline fraîche de travail et permet d'effectuer la lyse O / N 4 ° C dans un réfrigérateur. Pour effectuer test des comètes neutre: Faire travailler tampon de lyse neutre en ajoutant 1% de Triton X-100 et 10% de DMSO à neutre solution lyse des stocks (2,5 M de NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM de Tris, 1% de N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Préparer environ 25 ml de travail du tampon de lyse pour chaque puce. Préchauffer travailler tampon de lyse neutre à 43 ° C. Immerger puce dans un tampon de lyse chaud neutre de travail et permet d'effectuer la lyse O / N en 43 ° C incubateur. 5. électrophorèse Pour effectuer test des comètes alcaline: Retirez un tampon de lyse et rapidement rincer puce 1x PBS. Puce sécurisée dans une chambre d'électrophorèse avec le côté film de gel vers le bas à l'aide du ruban adhésif double-face. Amener la chambre à 4 ° C une chambre froide. Remplir la chambre avec un tampon alcalin d'électrophorèse froid (0,3 M de NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) à un niveau qui couvre seulement le gel. Permettre le déroulement alcaline pendant 40 min. Exécuter une électrophorèse à 1 V / cm et 300 mA pendant 30 minutes dans la chambre froide. Réglez le volume de tampon d'électrophorèse dans la chambre de réaliser courant de croisière souhaitée. Pour effectuer test des comètes neutre: Retirer le tampon de lyse et rincer la puce avec du tampon d'électrophorèse neutre (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, d'acide borique 90 mM, pH 8,5) pendant 2 x 15 min à 4 ° C. Puce sécurisée dans une chambre d'électrophorèse avec le côté film de gel vers le bas à l'aide du ruban adhésif double-face. Amener la chambre à 4 ° C une chambre froide. Remplir la chambre avec un tampon d'électrophorèse neutre froid (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, 90 mM acide borique, un pH de 8,5) à un niveau qui couvre seulement le gel. Laisser le gel de s'asseoir dans une chambre froide pendant 60 min. Exécuter une électrophorèse à 0,6 V / cm et 6 mA pendant 60 minutes dans la chambre froide. Ajuster le volume de tampon d'électrophorèse dans la chambre à atteindre le courant de fonctionnement désiré. 6. imagerie fluorescente Retirez la puce de la chambre d'électrophorèse de cold ambiante. Neutraliser les gels dans un tampon de neutralisation (0,4 M Tris, pH 7,5) pour 2 x 15 min dans 4 ° C réfrigérateur. Colorer la puce avec fluorescent colorant ADN de choix (c'est-à-SYBR Or, le bromure d'éthidium) sous l'usine procédures recommandées. Image en utilisant la microscopie à fluorescence. Analyse 7. données Analyser Images de comètes par le logiciel de test des comètes standard tel que Komet 5.5.

Representative Results

Dans ce premier exemple, nous décrivons l'approche pour quantifier les niveaux initiaux de dommages à l'ADN dans les cellules lymphoblastoïdes humaines après une exposition à des dommages oxydatifs à l'aide de H 2 O 2. Afin d'évaluer H 2 O 2 induites par des lésions de base et cassures simple brin, les conditions de comètes alcalines sont utilisées. Après le chargement est terminé et les cellules ont été encapsulé avec la superposition d'agarose, une plaque de 96 puits sans fond est pressée sur la surface pour créer 96 compartiments sur la puce. Chacun des 96 puits peuvent être dosés avec un type ou la concentration de produits chimiques différents. Ici quatre doses différentes de H 2 O 2 et ont été utilisés 1x PBS a été utilisé comme contrôle négatif. Des images représentatives de comètes déployées sont présentés dans la figure 1A, en cas de non-traitée (en haut), 50 uM (au milieu) et 100 uM (en bas) H 2 O 2 -exposed échantillons ont montré des niveaux différents de la queue des comètes. Analyse des images de la comète peut être performed en utilisant un logiciel disponible dans le commerce, ce qui permet de quantifier globalement des niveaux de dommages sur la base de la distance totale de l'intensité de fluorescence et de la migration de chaque queue de comète. Les mesures sont généralement effectuées sur 50 à 100 comètes par l'état et la valeur médiane (soit% de l'ADN de queue ou de la longueur de la queue) est calculée. Figure 1B illustre la courbe de réponse de l'ADN pourcentage de queue analysé des comètes de cellules lymphoblastoïdes TK6 exposées à quatre concentrations différentes de H 2 O 2. La cohérence entre les expériences indépendantes démontre l'efficacité de cette approche dans l'évaluation des dommages à l'ADN réponse de différents niveaux de traitements chimiques dans les cellules. Pour en savoir plus sur la variation entre les échantillons (par exemple, entre macrowells) et entre des répétitions de la même expérience, entre l'échantillon et la variabilité inter-expérimental a été tracée sur la figure 2A et 2B respectivement. Dans chaque expérience, chaque puits de la 96-wpuce ell est équivalent à un échantillon différent et donc la variation du puits à bien révèle l'inter-échantillon variante du dispositif. Ici, les cellules TK6 chargés dans les puits 12 de la puce 96 puits ont été traitées avec la même dose de H 2 O 2 et lysées immédiatement après le traitement. Toutes les autres étapes expérimentales ont été effectuées en parallèle et les médianes d'au moins 50 comètes de chaque macrowell ont été tracées sur la figure 2A. La moyenne des valeurs médianes est de 77,53% de l'ADN dans la queue, avec un écart type est de 3,99%. A partir de ces données, on calcule que le coefficient de variation entre les échantillons est de 5,2%, ce qui est plusieurs fois plus faible que le test traditionnel, ce qui démontre l'amélioration de la robustesse de ce dosage 6,16. Pour en apprendre davantage sur la reproductibilité de l'analyse, nous avons exposé les cellules TK6 dans une puce avec 75 uM H 2 O 2 et d'analyser le niveau immédiat de dommages à l'ADN. Cette expérience a été répétée six fois et les données de chaque expérience a été tracée en Figure 2B. Dans des conditions expérimentales identiques, nous avons obtenu des résultats allant de 41,76% à 57,87%, présentée comme barres grises dans la figure. La moyenne de six répétitions est de 49,57%, avec une erreur type de la moyenne de seulement 2,04%. La faible variation entre les répétitions implique que le test des comètes effectuées sur ce nouveau dispositif est hautement reproductible. Pour évaluer la cinétique de réparation, les cellules sont autorisés à réparer leur ADN dans un milieu frais après le traitement. Lyse macrowells à différents points dans le temps indique la variation de dommages à l'ADN au cours du temps. Un exemple est montré sur la figure 3. Dans cette expérience, les cellules ont d'abord été TK6 encapsulés dans la puce, traitées avec 50 uM de H 2 O 2, et on les laisse à réparer jusqu'à 60 min après l'exposition. Les cellules ont été lysées à 0, 20, 45 et 60 min respectivement. Comète images représentatives de différents points dans le temps sont représentées sur la figure 3A, et la variation des niveaux d'endommagement de l'ADN au cours du temps est tracée sur la figure3B. Ces données ont révélé que la quasi-totalité des dommages sont réparés dans les 45 minutes après H 2 O 2 traitement. De nombreuses variables peuvent influencer le taux de réparation, y compris le type de ligne de la cellule et de l'agent chimique utilisé. Ainsi les chercheurs peuvent apporter des modifications au protocole (par exemple, l'extension du temps de réparation) pour s'adapter à des besoins supplémentaires dans leurs enquêtes. Ici, nous offrons un autre exemple de l'expérience de réparation à l'aide de cette puce, dans laquelle les cellules TK6 sont mis au défi avec un autre génotoxique N-méthyl-N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) est un agent alkylant connu pour induire des lésions de base, y compris 7-méthylguanine et 3-méthyladénine. Ces lésions sont convertis avecBASIC sites les plus visités par dépurination spontanée ou par l'élimination enzymatique par glycosylases d'ADN. Le site abasique obtenu peut être clivé dans des conditions alcalines et, par conséquent détecté sur la puce. L'exposition initiale provoque une augmentation significative des dommages, évident à partir de la longuequeue, et au fil du temps ces queues sont réduits comme les cellules de restaurer l'ADN intact lors de la réparation. Bien que l'alkylation et les dommages oxydatifs sont tous deux principalement réparées par la voie de réparation par excision de base et la quantité de lésions générées et les protéines impliquées dans la réparation varient. Ces variations peuvent conduire à des taux de conversion avecBASIC sites, ainsi que des taux de réparation des sites de abasiques résultant. Dans la Figure 4, la cinétique de réparation de cellules TK6 exposés à 0,1, 1 et 3 ug / ml de MNNG sont présentés. Dans cette expérience, nous avons étendu le temps de l'expérience à 2 heures après l'exposition parce que les dommages MNNG induite semble persister plus longtemps et est effacé à un rythme plus lent par rapport à H 2 O 2 induite par les dommages. Analyse des CDB dans des conditions neutres est très similaire au protocole pour l'analyse des lésions simple brin en utilisant les conditions alcalines. Pour montrer l'ampleur des dégâts initiaux, TK6 ont été exposés à des niveaux variables de Gir, et les cellules résultantes ont été lysées et soumis à une électrophorèse à un pH neutre (figure 5A). Il est à noter que la morphologie de la queue de comète est différente des conditions d'essai alcalins. Pour obtenir l'ADN fragmenté observable en utilisant ce dosage, la dose IR utilisé est nettement plus élevée (de 0 à 100 Gy) à la dose nécessaire pour voir des dégâts dans les conditions alcalines. En outre, nous avons constaté que la longueur de la queue est le paramètre le plus sensible pour refléter le degré de dommages à l'ADN en utilisant le test des comètes neutre 7. La courbe dose-réponse de l'analyse est représenté sur la figure 5B. Réparation de l'ADN des cassures double brin dans les cellules peut également être évaluée, et a été montré par Weingeist et. al. 7. Dans l'ensemble, la CometChip neutre offre un outil précieux pour l'analyse à haut débit de l'ADN CDB. 1highres.jpg "width =" 500 "/> Figure 1. H 2 O 2 dose réponse des cellules TK6 utilisant test des comètes alcaline. (A) comètes de microplaques Rangée de lymphoblastes non traités TK6 (en haut) et les cellules TK6 exposées à 50 uM (au milieu) et 100 uM (en bas) H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. La barre d'échelle est de 100 um. (B) H 2 O 2 en réponse à la dose de cellules TK6 exposées à différents niveaux de H 2 O 2. Chaque point de données représente la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian queue ADN d'au moins 50 comètes individuels ont été obtenus dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Inter-échantillon et l'Inter-expérimentale variabilité. (A) variation échantillon à échantillon. cellules lymphoblastiques humaines TK6 ont été chargés dans les puits 12 de la puce 96 puits. Chaque puits a été exposé à 100 ul de 50 uM de H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. Les cellules ont été lysées immédiatement et analysé l'ADN% de la queue. Les données de chaque puits est montré ici. Chaque boîte représente la médiane au moins 50 comètes individuelles de chaque puits. Le moyen de 12 puits est 77,53%, l'écart type est de 3,99%, et le coefficient de variation est calculé à 5,2%. (B) variation expérience à l'expérience. cellules lymphoblastiques humaines TK6 ont été chargés dans la puce de 96 puits, sont exposés à 100 ul de 75 uM de H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. Les cellules ont été lysées immédiatement et analysé l'ADN% de la queue.La même expérience a été répétée six fois et les données de chaque répétition est représentée par une barre grise. Chaque boîte représente la médiane% queue ADN d'au moins 100 comètes individuelles de chaque répétition. La moyenne de 6 répétitions est de 49,57%, présentée comme la barre de revenir ici. L'écart-type de 6 répétitions est de 4,99%, et l'erreur-type de la moyenne est calculée comme étant de 2,04%, représentée comme la barre d'erreur dans la figure. Figure 3. Réparation de H 2 O 2 induite par des dommages dans les lymphoblastes TK6. (A) Schéma de l'étude de la réparation avec des comètes représentatives. TK6 sont traités avec des agents nocifs et autorisés à réparer dans les médias à 37 ° C avant la lyse. (B) la cinétique de réparation des cellules TK6 après traitement avec 50 uM H 2 O 2 pendant 20 min à 4 & #176; C. Chaque point de données représente la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian queue ADN d'au moins 50 comètes individuels ont été obtenus dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des expériences répétitives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. Réparation des dommages MNNG-induite dans les lymphoblastes TK6. TK6 sont traités avec 0,1, 1 et 3 pg / MNNG ml pendant 30 min à 4 ° C et doit être réparé dans les médias à 37 ° C jusqu'à 120 min après exposition. Le pourcentage moyen de l'ADN de queue d'au moins 50 comètes individuelles ont été obtenues pour chacun des trois expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent l'erreur-typede la moyenne de trois expériences indépendantes. Figure 5. Dose-réponse IR des cellules TK6 utilisant test des comètes neutre. (A) Parée microplaques comètes de lymphoblastes non traités TK6 (en haut) et les cellules TK6 exposées à 40 Gy (au milieu) et 80 Gy (en bas) irradiation gamma. La barre d'échelle est de 100 um. Réponse à la dose (B) IR de cellules TK6 exposées à différents niveaux d'irradiation gamma. Chaque point de données représente la longueur de la queue médian (um) d'au moins 300 comètes regroupées de six macrowells sur la puce. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Génotoxines omniprésents dans l'environnement et aussi à l'intérieur des cellules humaines exercent stress inévitable et les dommages à l'ADN cellulaire. En fait, il a été estimé qu'il existe 1,000s des lésions de l'ADN présent dans les cellules humaines à l'état stationnaire 18. Comprendre dommages sensibilité et la cinétique de réparation chez l'homme apporte non seulement un aperçu de la recherche fondamentale, mais bénéficie également du développement de médicaments. Ironiquement, malgré la possibilité de dommages à l'ADN pour favoriser le cancer, les agents endommageant l'ADN sont utilisées à des niveaux très élevés pour traiter le cancer, faire la connaissance de dommages à l'ADN et la réparation liées à la médecine personnalisée. Le CometChip est un dispositif qui utilise la nouvelle recherche pratiques de microfabrication de révolutionner un dosage de dommages à l'ADN long existé. S'appuyant sur les mêmes principes de l'essai de comète traditionnelle, la puce offre un débit nettement plus élevé et une meilleure reproductibilité. Nous décrivons ici les méthodes d'utilisation de cette puce. Pour clarifier son utilité et de robustesse, nous montrons des résultats vientm plusieurs expériences où la puce a été utilisé pour évaluer les dommages induits par plusieurs agents endommageant l'ADN différents, et où il a été utilisé pour évaluer réparation de l'ADN. Ensemble, les résultats présentés ici fournissent des informations utiles pour l'utilisation de la puce et de démontrer son large champ d'application de la recherche sur les lésions de l'ADN et la réparation.

L'une des étapes les plus importantes de ce protocole est d'accomplir le chargement efficace des cellules. De nombreuses lignées cellulaires ont été testés sur ce système, y compris à la fois la suspension et des cellules adhérentes. Chargement efficacité dépend de nombreuses variables telles que le type de cellules, la taille des cellules, de la concentration et du temps de chargement. lignées de cellules en suspension telles que les cellules lymphoblastoïdes sont les plus faciles à travailler avec. La concentration de la suspension de cellules peut varier de 10 4 à 10 6 cellules par 96 puits et le chargement terminé habituellement en 15 à 30 min. Densité cellulaire plus élevée facilite le chargement et réduit la quantité de temps nécessaire pour que les cellules sédimenter dans les micropuits.

paramètres de charge pour les cellules adhérentes peuvent différer des cellules en suspension. Des lignées cellulaires telles que l'ovaire de hamster chinois (CHO), se sont révélés avoir une efficacité de chargement similaire à celui de cellules en suspension (suite de la trypsine) et en utilisant les conditions de chargement similaires ainsi. D'autres types de cellules, comme les cellules tumorales qui forment facilement des agrégats de cellules en suspension, nécessitent un traitement supplémentaire. Passe suspensions cellulaires à travers un filtre à une seule cellule et l'addition de trypsine au support de suspension peut supprimer la formation de groupes de cellules lors du chargement. Enfin, en termes de temps de chargement, le temps nécessaire pour la capture des lignées de cellules adhérentes dans des micropuits peut varier de 20 min à 1 h. En conséquence, il est recommandé aux utilisateurs d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer les conditions optimales de chargement avant de procéder à d'autres investigations. Chargement efficacité peut être visualisé sous un microscope en champ lumineux ou plus précisément révélé par coloration des cellules encapsulées avec DAPI ou un autre ADNtaches antérieures à l'évaluation dans le cadre du microscope à fluorescence.

Un avantage majeur de cette méthode et de la puce est la polyvalence. Premièrement, les chercheurs ne sont pas limités à une concentration spécifique de cellules de travail parce que les cellules excédentaires sont emportées, et la puce assure uniforme comète densité. Ensuite, les puits peuvent être réalisés avec des tailles variables pour tenir compte de formats différents types de cellules. Dans des circonstances que plusieurs cellules sont capturées en une seule cupule, comètes multi-cellulaires sont les résultats de l'auto-calibré et de rendement cohérents par rapport aux comètes unicellulaires 6,7. Un autre avantage de motif sur un micro-réseau dans des cellules est que les comètes sont alors dans le même plan focal à des positions fixes, à réduire le bruit dû à des comètes floues et de faciliter l'imagerie et l'analyse automatisée. Les améliorations significatives de débit et fournies par la sensibilité CometChip permettent l'application de l'essai pour des études de grande échelle. Dans l'ensemble, la puce fournitsa outil précieux pour l'évaluation des dommages de l'ADN pour les chercheurs, des toxicologues, des cliniciens et des épidémiologistes.

Alors que le test des comètes est connu pour son excellente sensibilité dans la détection d'un large éventail de lésions de l'ADN, ce test souffre également d'une faible spécificité. L'utilisation de ce protocole permet d'améliorer considérablement le rendement et la reproductibilité de l'essai, mais ne prouve pas l'avancement de la spécificité. Néanmoins, le dosage de multiplexage avec d'autres méthodes ont été rapportés pour être efficace pour atteindre une plus grande spécificité. Un exemple est l'inclusion d'enzymes spécifiques de lésions purifiés. Ces enzymes peuvent convertir des lésions de base autrement indétectables dans ruptures de brins détectables et les sites abasiques 1,19-21. Un exemple largement utilisé est la réparation endonucléase formamidopyrimidine-ADN glycosylase (FPG), qui révèle modifications de l'ADN de l'oxydation 19,22. Étant donné que l'étape de digestion enzymatique est appliquée après la lyse cellulaire, le système peut être traité de la même manière unsa lame de agarose traditionnel sans modifications au protocole. Bien que le protocole détaillé n'est pas décrit ici, cette approche a été adaptée par de nombreux utilisateurs de test des comètes traditionnelles dans le passé et les protocoles peut être facilement trouvé. Dans une publication précédente, nous avons utilisé cette méthode pour identifier les dommages induits par la lumière fluorescente 22.

L'avantage majeur de cette méthode est le débit qu'il fournit, ce qui ouvre la porte à des études qui étaient auparavant presque impossible. La capacité de traiter 96 échantillons sur la même plate-forme non seulement de réduire la main-d'œuvre et de temps, mais réduit également les bruits expérimentaux et améliore considérablement la reproductibilité. Inter variation de l'échantillon est nettement plus faible que la variation traditionnel coulisseau à glissière, qui peut être deux fois plus élevée que la variation observée avec cette puce 6,7. Réduction du bruit conduit également à une meilleure sensibilité, permettant de détecter des différences plus subtiles entre les échantillons. Parce que le dispositif utilise un standard format de 96 puits, il est compatible avec les équipements de recherche générale et HTS technologies. Envisager une étude qui nécessite une évaluation de 100 échantillons, en supposant qu'un chercheur moyenne peut traiter ~ 30 lames de verre au cours de plusieurs jours. Étant donné que chaque échantillon doit être effectuée trois fois, il faudrait environ un mois pour terminer une telle étude, qui serait également subir inévitablement de l'échantillon à la variation de l'échantillon. En revanche, le traitement de 100 conditions, chacun en trois exemplaires, avec cette puce ne nécessite que quelques plaques et peuvent être effectuées en trois jours. Cette amélioration importante du débit ouvre la porte à des études qui étaient auparavant inaccessibles.

Le protocole présenté ici décrit à la fois les procédures de base pour la réalisation du test comète norme et les étapes modifiés nécessaires pour utiliser la plate-forme de CometChip. Avec la possibilité de mesurer à la fois inhérents niveaux de dommages à l'ADN et la réponse de réparation ultérieure, le dosage est très pertinente pourun grand nombre d'applications biologiques et cliniques. Informations sur l'impact des expositions aux produits chimiques spécifiques sur le génome facilite la prévention et le traitement des maladies. En outre, il ya également un intérêt important dans la détermination des variations de dommages à l'ADN sensibilité et la capacité de réparation chez les personnes 23,24. Cette technique fournit le débit nécessaire pour ces études à grande échelle. La connaissance des variations inter-individuelles est essentielle pour identifier les personnes sensibles et au développement de thérapies individualisées ou des stratégies de préventions. Pris dans leur ensemble, la technologie présentée ici fournit un haut débit, dommages à l'ADN objective et quantitative plate-forme d'analyse qui a le potentiel de devenir une méthode standard dans un avenir proche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été en charge principalement par 5 UO1-ES016045 avec le soutien partiel de 1-R21-R44-ES019498 et ES021116. DMW a été soutenu par la subvention de formation NIEHS en toxicologie environnementale T32-ES007020. Matériel a été fourni par le Centre de sciences de la santé de l'environnement P30-ES002109.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
UltraPure LMP Agarose (low melting point) Invitrogen 16520 Multiple suppliers
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco by life technologies 14190 Multiple suppliers
Crystalline NaCl Macron Chemicals 7581-06 Multiple suppliers
Crystalline Na2EDTA Macron Chemicals 4931-04 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (base) Sigma-Aldrich T1503 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (acid) J.T.Baker 4106 Multiple suppliers
Crystalline N-lauroylsarcosine Sigma-Aldrich L9150 Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect
Crystalline NaOH Macron Chemicals 7708-06 Multiple suppliers, Corrosive
Hydrochloric acid VWR BDH3871 Multiple suppliers, Corrosive
Crystalline boric acid Sigma-Aldrich B6768 Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard
Name of Equipments Company Catalog Number Comments
CometChip Trevigen Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary
1-well dish Thomas Scientific 73521-420
Bottomless 96-wel plate VWR 655000-06
1.5″ binder clips Staples Multiple suppliers
Glass plate Tag Hardware Customized to size of 96-well plate
Owl Horizontal Electrophoresis System VWR 27372-131 Multiple suppliers
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050 Multiple suppliers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
  2. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
  3. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  4. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
  5. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
  6. Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
  7. Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
  8. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  9. Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
  10. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
  11. Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, 1-42 (2005).
  12. Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
  13. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
  14. McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
  15. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
  16. Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
  17. Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
  18. Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
  19. Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , (2010).
  20. Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
  21. Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
  22. Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
  23. Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
  24. Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).

Tags

DNA DamageComet AssayCometChipHigh-throughput96-well PlatformMicroarrayDNA Damaging AgentsGenotoxicity TestingDrug DevelopmentEpidemiological StudiesClinical Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ge, J., Prasongtanakij, S., Wood, D. K., Weingeist, D. M., Fessler, J., Navasummrit, P., Ruchirawat, M., Engelward, B. P. CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells. J. Vis. Exp. (92), e50607, doi:10.3791/50607 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image