JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Bioengineering

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Published: October 18, 2014
doi:
10.3791/50607
, , , , , , ,
1Department of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology,Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering,University of Minnesota

Summary

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

Abstract

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Introduction

A eletroforese em gel de célula única (SCGE) ensaio (também conhecido como o teste do cometa) é uma técnica amplamente utilizada para a quantificação de um amplo espectro de lesões de DNA, incluindo lesões da base, sitios não básicos, rupturas dos filamentos individuais, rupturas de filamentos duplos, ligações cruzadas e sensível alcalino locais. O princípio subjacente ao doseamento é que o DNA danificado migra mais rapidamente do que o ADN não danificado devido a fragmentação e perda de estrutura superhelical. A extensão da migração é proporcional à quantidade de dano de ADN, e podem ser visualizados por microscopia de fluorescência. -Captura de imagem e análise de perfil de intensidade de DNA em forma de cometa indivíduo em seguida, entregar as medições de parâmetros tais como o comprimento da cauda, ​​momento de cauda, ​​e% DNA na cauda para revelar o nível de danos no DNA em uma célula 1-4.

Atualmente, existem duas versões comumente utilizados do ensaio do cometa: a) ensaio cometa alcalino e b) teste do cometa neutro. O ensaio cometa alcalino é o mais amplamenteversão utilizada, que usa um tampão de pH elevado para relaxar antes de eletroforese de DNA e, assim, detectar todos os tipos de quebras de fita e sítios álcali-sensíveis. O ensaio do cometa neutro, por outro lado, é menos experiente porque usa um tampão neutro para manter as hélices duplas e detectar apenas quebras da cadeia dupla 2,5. Para agentes químicos e físicos que induzem DSBs, SSBs são criados em conjunto, e são formadas em níveis muito mais elevados (por exemplo, SSBs induzidas γIR são uma ordem de magnitude mais comum do LAP). Para a maioria de DNA exposições prejudiciais, LAP são muito menos freqüentes do que outras classes de danos no DNA, e são, portanto, mais difíceis de detectar. Temos demonstrado em publicações anteriores, a janela de detecção de ambas as versões. 6,7

Embora o teste do cometa tem sido utilizado rotineiramente para pesquisa básica sobre danos e reparo do DNA e testes de genotoxicidade 1,2,8-15, o ensaio foi relatado ter fraca reprodutibilidade devido à amostra-a-exemplo, pessoa-a-pessoa e variabilidade de laboratório para laboratório. Além disso, o ensaio é de baixa taxa de transferência, em parte porque a aquisição de imagem e análise de dados são trabalhosos. Juntas, essas limitações contribuem para a sua relativamente baixa aceitação em estudos de grande escala. Através da integração de tecnologias e princípios de engenharia, o CometChip traz uma solução para os problemas de rendimento e inconsistências que estão associados com o ensaio cometa tradicional 6,7. Resumidamente, para criar o chip, de um molde é microfabricados utilizando fotolitografia para criar microposts com diâmetros tão pequenos como a de uma única célula. O molde é, então, utilizada para estampar em agarose fundida, resultando num conjunto de micropoços depois solidifica gel. Fichas estão sendo desenvolvidos para fornecer aos pesquisadores poços de tamanho variável para compatível com diferentes tipos de células. Para carregar o chip, as células em meios de comunicação estão autorizados a instalar-se nos poços de gravidade; células em excesso são lavados. As células são então presos nos encapsuladoção de uma fina camada de agarose de baixo ponto de fusão, e uma placa de 96 cavidades sem fundo é então presa à superfície do gel para criar macrowells 96, cada um com centenas de micropoços na sua superfície inferior.

Este protocolo descreve os procedimentos gerais para experimentos com esse chip, que incluem preparação de gel, o carregamento de células, dosagem e reparação, a lise celular, eletroforese, e imagens fluorescentes. Demonstramos dois exemplos de experiências de resposta à dose com células linfoblásticas expostas conhecido agentes danificadores de ADN, utilizando versões neutras e alcalinas de ensaio, respectivamente. Duas experiências de reparação também são mostradas a descrever como a resposta de reparação pós-exposição pode ser avaliada usando o sistema.

Protocol

1 Preparação de Chip Remover gel chip da embalagem e coloque em um lado de um filme bem placa retangular, gel para baixo. Lavar em gel em 25 ml de 1x PBS durante 15 min, repetir duas vezes. Situado em gel em placa de vidro e da orientação da etiqueta de gel em conformidade. Pressione suavemente um fundo placa de 96 poços invertido no gel; certificar-se de que todas as cavidades da placa de fundo bem dentro da área do gel. Use 1,5 '' grampos da pasta em cada lado da placa de fixação para fixar com o vidro. Aspirar o excesso de tampão PBS em cada poço. 2. Carregando Células Preparar suspensões de células: Para as linhas de células em suspensão, dilui-se a suspensão de células no meio para se obter uma concentração final de 10 5 a 10 6 células / ml. Para as linhas de células aderentes, siga DESMONTAR / protocolos tripsinização normais e dilute células isoladas em meio a uma concentração final de 10 5 a 10 6 células / ml. Se as células agregam, passar a suspensão das células em um filtro de células para obter uma suspensão de célula única. Adicionar 100 ul de suspensão celular a cada poço da placa de 96 poços. Cobrir a placa com película de gel para evitar a evaporação dos meios de comunicação. Permitir que as células de carga durante pelo menos 30 minutos em 37 ° C incubadora. Remover chip da mídia incubadora e aspirado de cada poço. Remover grampos da pasta e sem fundo placa de 96 poços; segurar o chip, com a placa de vidro, num ângulo e lavar com 1x PBS para remover o excesso de células em agarose. Verifique carregamento celular usando um microscópio de campo claro com uma lente objetiva de 4X. Se o carregamento não se tem observado, repita a partir do passo 2.1. Coloque chips carregados numa superfície uniforme (bancada de laboratório). Chip de sobreposição com 1% de baixo ponto de fusão (LMP) de agarose, que é pré-aquecido a 37 ° C. Use aproximadamente 2̵1, 3 ml de agarose LMP é necessária para cada chip. Permitir sobreposição para solidificar primeiro à temperatura ambiente durante 3 minutos e em seguida mover-se para 4 ° C durante 5 min refrigerador para a gelificação completa. 3. Dosagem e Reparação NOTA: Para estudo de base nível de dano do DNA, pule para o Passo 4. Alinhar cuidadosamente os poços de o chip (criado a partir de aperto anterior), com os poços de um novo fundo de 96 poços da placa. Re-pressione o fundo placa de 96 poços em aperto superior e prenda com grampos da pasta. Adicionar 100 ul de química de dose desejada para cada poço da placa de 96 poços; realizar dosagem / tratamento em gelo ou a 4 ° C em frigorífico durante período de tempo desejado. Após a dosagem, produtos químicos aspirado de cada poço e lavar afastado químico residual usando 1x PBS. Se o dano direto é estudada aqui, vá para a Etapa 4. Para estudar a cinética de reparação, permitir que as células no chip para reparar emmeios de comunicação, a 37 ° C. Lyse (vá para a Etapa 4) em momentos específicos. NOTA: O reparo pode ser realizada on-chip com um fundo da placa de 96 poços em anexo, ou o chip pode ser cortado em partes separadas, após a remoção do fundo da placa de 96 poços. 4. Lise Para realizar o ensaio cometa alcalino: Fazer funcionar tampão de lise alcalina pela adição de 1% de Triton X-100 a alcalino solução estoque de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de Na 2 EDTA, 10 mM Tris, de pH 10). Prepare a cerca de 25 ml de tampão de lise de trabalho para cada chip. Pré-tampão de lise frio de trabalho alcalino, a 4 ° C. Submerge chip no tampão de lise frio de trabalho e permitir que a lise alcalina para executar O / N a 4 ° C em frigorífico. Para realizar o teste do cometa neutro: Fazer funcionar tampão de lise neutro através da adição de 1% de Triton X-100 e 10% de DMSO a uma solução estoque de lise neutro (2,5 M NaCl, 100 mM de Na 2 EDTA, 10mM de Tris, 1% de N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Prepare a cerca de 25 ml de tampão de lise de trabalho para cada chip. Pré-aquecer a trabalhar tampão de lise neutro a 43 ° C. Submerge chip no tampão de lise de trabalho quente neutra e permitir realizar a lise S / N em 43 ° C incubadora. 5. Eletroforese Para realizar o ensaio cometa alcalino: Remover o tampão de lise e lavar rapidamente com chip de 1x PBS. Chip de seguro em uma câmara de eletroforese com gel lado filme voltado para baixo usando a fita dupla face. Traga a câmara a 4 ° C, uma sala fria. Encher a câmara com tampão frio electroforese alcalina (NaOH 0,3 M, 1 mM de Na 2 EDTA) a um nível que apenas cobre o gel. Permitir para relaxar alcalina por 40 min. Executar electroforese a 1 V / cm e 300 mA durante 30 minutos em câmara fria. Ajuste o volume de tampão de eletroforese no chaMBER alcançar corrente que desejado. Para realizar o teste do cometa neutro: Remover o tampão de lise e enxaguar chip com tampão de electroforese neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5), durante 2 x 15 min a 4 ° C. Chip de seguro em uma câmara de eletroforese com gel lado filme voltado para baixo usando a fita dupla face. Traga a câmara a 4 ° C, uma sala fria. Encher a câmara com tampão de electroforese neutro frio (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5) a um nível que apenas cobre o gel. Permitir que o gel de sentar-se em câmara fria por 60 minutos. Executar electroforese a 0,6 V / cm e 6 mA durante 60 minutos em câmara fria. Ajustar o volume de tampão de electroforese na câmara até atingir actual funcionamento desejado. 6. imagem fluorescente Remover chip da câmara de electroforese de colsala d. Neutraliza-se os géis em tampão de neutralização (0,4 M Tris, pH 7,5), durante 2 x 15 min em 4 ° C frigorífico. Manchar o chip com mancha DNA fluorescente de escolha (ou seja, ouro SYBR, brometo de etídio) sob a fábrica recomenda procedimentos. Imagem por microscopia fluorescente. Análise de Dados 7. Analisar imagens do cometa por software ensaio cometa padrão como Komet 5.5.

Representative Results

Neste primeiro exemplo, descreve-se a abordagem para a quantificação dos níveis iniciais de danos ao DNA em células linfoblastóides humanas após exposição a dano oxidativo utilizando H 2 O 2. A fim de avaliar a H 2 O 2 a lesões induzidas por base e quebras de cadeia simples, são utilizadas condições de cometa alcalinas. Após o carregamento está completo e as células foram encapsuladas com a camada de agarose, um fundo de 96 poços da placa é pressionada contra a superfície 96 para criar-compartimentos no chip. Cada um dos 96 poços pode ser doseada com um tipo ou a concentração de produtos químicos diferentes. Aqui foram utilizadas quatro doses diferentes de H 2 O 2 e 1x PBS foi utilizado como controlo negativo. Imagens representativas de cometas dispostas são mostrados na Figura 1A, em que o não-tratada (em cima), 50 ^ M (meio) e 100 uM (parte inferior) H 2 O 2 -exposed amostras demonstrado diferentes níveis de cauda do cometa. Análise de imagens de cometa pode ser performed utilizando software disponível comercialmente, que geralmente quantifica os níveis de danos com base na intensidade da fluorescência e da migração distância total de cada cauda do cometa. Medidas são comumente realizados em 50 a 100 cometas por condição e do valor médio (ou rabo% DNA ou comprimento da cauda) é calculado. Figura 1B ilustra a curva de resposta DNA percentual cauda analisados ​​a partir das TK6 cometas celulares linfoblastóides expostos a quatro concentrações diferentes de H 2 O 2. A consistência entre os experimentos independentes demonstra a eficácia desta abordagem na avaliação da resposta a danos do DNA de vários níveis de tratamentos químicos nas células. Para aprender mais sobre a variação entre as amostras (por exemplo, entre macrowells) e entre as repetições da mesma experiência, inter-amostra e da variabilidade inter-experimental foi representada graficamente na figura 2A e 2B, respectivamente. Dentro de cada experiência, cada uma das cavidades da 96-wchip de ell é equivalente ao de uma amostra diferente e, por conseguinte, a variação de poço a poço revela a variação inter-amostra do dispositivo. Aqui, TK6 carregadas em poços de 12 a 96 poços de chips foram tratados com a mesma dose de H 2 O 2 e imediatamente lisadas após o tratamento. Todas as outras etapas experimentais foram realizados em paralelo e as medianas de pelo menos 50 cometas de cada macrowell foram plotados na Figura 2A. A média das medianas é 77,53% no ADN da cauda, ​​com o desvio padrão é de 3,99%. A partir destes dados, calcula-se que o coeficiente de variação entre as amostras é de 5,2%, o que é várias vezes inferior do que o tradicional ensaio, o que demonstra a melhoria da robustez deste ensaio de 6,16. Para aprender mais sobre a reprodutibilidade do ensaio, foram expostas TK6 num chip com 75 pM de H 2 O 2 e analisar o nível imediata de danos no ADN. Esta experiência foi repetida seis vezes e os dados de cada experiência foi representada graficamente em Figura 2B. Sob condições experimentais idênticas, obtivemos resultados que variaram entre 41,76% e 57,87%, mostrado como barras cinzentas na figura. A média de seis repetições é 49,57%, com o erro padrão da média de apenas 2,04%. A baixa variação entre repetições implica que o teste do cometa realizadas neste novo dispositivo é altamente reprodutível. Para avaliar a cinética de reparação, as células são permitidos para reparar o ADN em meio fresco após o tratamento. Lise macrowells em vários pontos de tempo revela a mudança no dano do DNA ao longo do tempo. Um exemplo é mostrado na Figura 3. Nesta experiência, as células foram encapsuladas TK6 primeiro no chip, tratadas com 50 pM de H 2 O 2, e deixou-se reparar e 60 minutos pós-exposição. As células foram lisadas com 0, 20, 45 e 60 min, respectivamente. Comet imagens representativas em diferentes pontos de tempo são mostrados na Figura 3A, e a mudança nos níveis de danos de DNA ao longo do tempo está traçada na figura3B. Estes dados revelaram que quase todo o dano é reparado no prazo de 45 min pós H 2 O 2 tratamento. Muitas variáveis ​​podem afetar a taxa de reparação, incluindo o tipo de linha celular e agente químico utilizado. Por isso os pesquisadores podem fazer alterações ao protocolo (ou seja, aumentando o tempo de reparação) para acomodar as necessidades adicionais em suas investigações. Aqui nós fornecemos um outro exemplo de reparação experiência usando este chip, onde TK6 são desafiados com um agente genotóxico diferente N-metil-N '-nitro-N -Nitrosoguanidine (MNNG) é um agente alquilante conhecida por induzir lesões de base, incluindo 7-metilguanina e 3-metiladenina. Estas lesões são convertidos em sítios abásicos, quer por despurinação espontânea ou por remoção enzimática por glicosilase de ADN. O sítio abásico resultante pode ser clivada sob condições alcalinas e, assim, detectada no chip. Exposição inicial provoca um aumento significativo no dano, evidente a partir da longacaudas, e ao longo do tempo essas caudas são reduzidas como as células restaurar DNA intacto durante o reparo. Apesar de alquilação e danos oxidativos são reparadas principalmente por tanto a via de reparação de excisão de bases, a quantidade de lesões geradas e as proteínas envolvidas na reparação variar. Estas variações podem conduzir a diferentes taxas de conversão em sítios abásicos, bem como diferentes taxas de reparação dos sítios abásicos resultantes. Na Figura 4, a cinética de reparação de TK6 expostos a 0,1, 1, e 3 ug / ml de MNNG são mostrados. Neste experimento, estendeu o tempo de experiência de 2 horas após a exposição, porque o dano induzido por MNNG parece persistir por mais tempo e é eliminado em um ritmo mais lento em comparação com H 2 O 2 induzida por danos. Análise de LAP, usando condições neutras é muito semelhante ao protocolo para a análise de lesões de cadeia simples, utilizando as condições alcalinas. Para mostrar os níveis de danos iniciais, TK6 foram expostos a níveis variáveis ​​de Gir, e as células resultantes foram lisadas e submetidas a electroforese a um pH neutro (Figura 5A). É digno de nota que a morfologia das caudas de cometa é diferente das condições de ensaio alcalinas. Para obter o DNA fragmentado observável com este ensaio, a dose IV utilizado é significativamente mais elevada (0-100 Gy) do que a dose necessária para ver danos usando as condições alcalinas. Além disso, verificou-se que o comprimento da cauda é o parâmetro mais sensível para refletir a extensão dos danos do DNA quando se utiliza o teste do cometa neutro 7. A curva de resposta a dose analisada é ilustrada na Figura 5B. Reparação de ADN quebras de cadeia dupla em células também pode ser avaliada, e foi mostrado por Weingeist et. al. 7. Tomados em conjunto, o CometChip neutro oferece uma valiosa ferramenta para análise de alta taxa de transferência de DNA LAP. "Width =" 1highres.jpg 500 "/> Figura 1. H 2 O 2 de dose de resposta de células utilizando o ensaio TK6 cometa alcalino. (A) cometas micropoços dispostas de linfoblastos não tratados TK6 (topo) e TK6 expostas a 50 ^ M (meio) e 100 uM (parte inferior) H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. A barra de escala é 100 um. (B) H 2 O 2 a resposta à dose de TK6 expostas a níveis diferentes de H 2 O 2. Cada ponto de dados é a média de três experiências independentes, em que a percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido em cada experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Inter-Sample e Inter-Experimental variabilidade. (A) variação de amostra-a-amostra. As células linfoblásticas humanas TK6 foram carregadas em poços de 12 a 96 poços de chip. Cada poço foi exposto a 100 ul de 50 uM de H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. As células foram de imediato lisadas e ensaiadas quanto à% de ADN da cauda. Os dados de cada poço é mostrado aqui. Cada caixa representa a mediana de, pelo menos, 50 cometas individuais de cada poço. A média das 12 cavidades é 77,53%, o desvio padrão é de 3,99%, e o coeficiente de variação é calculada para ser 5,2%. (B) variação Experiment-to-Experiment. As células linfoblásticas humanas TK6 foram carregados para o chip de 96 poços, expostas a 100 ul de 75 uM de H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. As células foram de imediato lisadas e ensaiadas quanto à% de ADN da cauda.A mesma experiência foi repetida 6 vezes e os dados de cada repetição é mostrado como uma barra cinzenta. Cada caixa representa a mediana% da cauda de ADN de pelo menos 100 cometas individuais de cada repetição. A média de 6 repetições é 49,57%, como a barra de volta aqui. O desvio padrão de seis repetições é de 4,99%, e o erro padrão da média é calculada para ser de 2,04%, representado como a barra de erro na figura. Reparação de H 2 O 2 induzida por danos Figura 3. Nos linfoblastos TK6. (A) Esquema do estudo de reparo com cometas representativas. TK6 são tratadas com agentes de danificação e deixou-se em meios de reparar a 37 ° C antes da lise. (B) uma cinética de reparação de TK6 após o tratamento com 50 uM de H 2 O 2 durante 20 minutos a 4 & #176; C. Cada ponto de dados é a média de três experiências independentes, em que a percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido em cada experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média a partir de experimentos repetidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Reparação dos danos induzidos pela MNNG em linfoblastos TK6. TK6 são tratados com 0,1, 1, e 3 ug / ml de MNNG durante 30 min a 4 ° C e deixou-se em meios de reparar a 37 ° C até 120 minutos pós exposição. A percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido para cada uma das três experiências independentes. As barras de erro representam o erro padrãoda média de três experiências independentes. Figura 5. Resposta a dose IV de TK6 utilizando o ensaio cometa neutro. (A) em matriz cometas micropoços de linfoblastos não tratados TK6 (em cima) e TK6 expostas a 40 Gy (meio) e 80 Gy (inferior) irradiação gama. A barra de escala é 100 um. Dose-resposta (B) IR de TK6 expostos a vários níveis de radiação gama. Cada ponto representa o comprimento da cauda mediana (mm) de pelo menos 300 cometas agrupados de seis macrowells no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Genotoxinas onipresente no meio ambiente e também dentro das células humanas exercem estresse inevitável e danos ao DNA celular. De facto, foi estimado que existem 1,000 s de lesões do ADN presentes em células humanas em estado estacionário 18. Entender a susceptibilidade a danos e cinética de reparo em humanos não só traz conhecimento para a pesquisa básica, mas também beneficia o desenvolvimento de drogas. Ironicamente, apesar de a capacidade de dano ao DNA para promover o câncer, agentes danificadores do ADN são utilizados em níveis muito elevados para o tratamento de câncer, fazendo com que o conhecimento sobre o dano ao DNA e reparar relevantes para a medicina personalizada. O CometChip é um dispositivo de pesquisa romance que utiliza práticas de microfabricação para revolucionar um ensaio de dano ao DNA de longa existiu. Com base nos mesmos princípios do ensaio do cometa tradicional, o chip oferece significativamente maior rendimento e melhor reprodutibilidade. Descrevemos aqui métodos para usar este chip. Para esclarecer sua utilidade e robustez, mostramos resultados from várias experiências em que o chip foi usado para avaliar os danos induzidos por vários agentes que danificam o ADN diferente, e desde que tenha sido utilizado para avaliar a reparação do ADN. Juntos, os resultados aqui apresentados fornecem informações úteis para o uso do chip e demonstrar sua ampla aplicabilidade a investigação sobre os danos e reparo do DNA.

Um dos passos mais importantes neste protocolo é realizar o carregamento de células eficaz. Muitas linhas celulares foram testadas neste sistema, incluindo tanto a suspensão e as células aderentes. Carregando a eficácia depende de muitas variáveis ​​tais como o tipo de células, o tamanho das células, a concentração de carga e tempo. Linhas de células em suspensão, tais como células linfoblastoides são os mais fáceis de se trabalhar. A concentração da suspensão de células pode variar de abril 10-junho 10 células por 96 poços e carregamento normalmente completa em 15-30 min. Densidade celular mais elevada facilita o carregamento e diminui a quantidade de tempo necessário para que as células se instalam nos micropoços.

Parâmetros de carregamento de células aderentes pode ser diferente a partir de células em suspensão. As linhas celulares, tais como de ovário de hamster chinês (CHO) células, foram encontrados a ter semelhante eficiência de carga, como as células em suspensão (a seguir tripsinização) e, assim, utilizar condições de carga semelhantes. Outros tipos de células, tais como células tumorais que formam facilmente agregados de células em suspensão, requerem um tratamento adicional. Passando suspensões de células através de um filtro de uma única célula e adicionando tripsina para a mídia suspensão pode suprimir a formação de grupos de células durante o carregamento. Finalmente, em termos de tempo de carga, o tempo requerido para a captura de linhas de células aderentes em micropoços pode variar de 20 minutos a 1 hora. Como resultado, é recomendável que os usuários realizam experiências-piloto para determinar as condições de carga ideais antes de proceder a novas investigações. Carregando eficácia pode ser visualizada sob um microscópio de campo brilhante ou, mais precisamente através da coloração revelou que as células encapsuladas com DAPI ou outro DNAmanchas antes da avaliação sob o microscópio fluorescente.

Uma grande vantagem deste método é a versatilidade e chip. Primeiro, os pesquisadores não estão restritos a uma concentração de células de trabalho específico, porque as células em excesso são lavados, eo microarray garante uniforme cometa densidade. Em segundo lugar, os micropoços podem ser feitas com tamanhos variados para acomodar os tipos de células de diferentes tamanhos. Em circunstâncias que várias células são capturadas em uma única microplaca, cometas multi-celulares são resultados de auto-calibrada e rendimento consistente em comparação com os cometas unicelulares 6,7. Outro benefício da padronização de células em um microarray é que todos os cometas são então no mesmo plano focal com posições fixas, reduzindo o ruído causado por cometas desfocados e facilitando a imagem e análise automatizada. As melhorias significativas no rendimento e sensibilidade fornecidas pelo CometChip permitir a aplicação do ensaio para os estudos de grande escala. Tomados em conjunto, o chip fornecersa ferramenta valiosa para avaliação de danos de DNA para pesquisadores, toxicologistas, epidemiologistas e clínicos.

Enquanto o ensaio de cometa é conhecida pela sua excelente sensibilidade na detecção de uma ampla gama de danos no ADN, este ensaio também padece de baixa especificidade. Usando este protocolo melhora a reprodutibilidade e rendimento do ensaio, mas não demonstra avanço na especificidade. No entanto, o ensaio de multiplexagem com outras metodologias tem sido relatada como sendo eficaz na obtenção de uma maior especificidade. Um exemplo é a inclusão de enzimas específicas de lesão purificadas. Estas enzimas podem converter lesões de base de outra forma indetectáveis ​​em rupturas dos filamentos detectáveis ​​e sítios abásicos 1,19-21. Um exemplo amplamente utilizado é o reparo endonuclease-DNA formamidopyrimidine glicosilase (FPG), o que revela modificações no DNA oxidativo 19,22. Uma vez que o passo de digestão enzimática é aplicado após a lise celular, o sistema pode ser tratado da mesma maneira que umsa tradicional slides agarose sem alterações no protocolo. Embora o protocolo detalhado não é aqui descrito, esta abordagem foi adaptada por muitos utilizadores ensaio cometa tradicionais no passado e os protocolos podem ser facilmente encontrados. Em publicação anterior, foi utilizado este método para identificar induzida por luz fluorescente dano 22.

A maior vantagem deste método é a taxa de transferência que proporciona, que abre as portas para os estudos que foram anteriormente virtualmente impossível. A capacidade de processamento de 96 amostras na mesma plataforma, não só reduz o trabalho e o tempo, mas também reduz o ruído experimental e aumenta muito a reprodutibilidade. Variação inter amostras é significativamente menor do que a variação tradicional slide-a-deslizante, que pode ser 2 vezes maior do que a variação observada com este chip 6,7. Redução de ruído também leva a melhor sensibilidade, permitindo a detecção de diferenças mais sutis entre as amostras. Uma vez que o dispositivo emprega um standard formato de 96 poços, é compatível com equipamentos de investigação geral e HTS tecnologias. Considere-se um estudo que requer uma avaliação de 100 amostras, assumindo que um pesquisador média pode processar ~ 30 lâminas de vidro ao longo de vários dias. Tendo em conta que cada amostra deve ser realizada em triplicado, que levaria cerca de um mês para completar esse estudo, que também sofreria inevitavelmente de amostra para amostra variação. Em contraste, o processamento de 100 condições, cada um em triplicado, com este chip requer apenas alguns pratos e pode ser realizada em três dias. Esta melhoria significativa na taxa de transferência abre as portas para estudos que antes eram inatingíveis.

O protocolo aqui apresentado descreve ambos os procedimentos básicos para a realização do teste do cometa padrão e as etapas modificadas necessários para usar a plataforma CometChip. Com a capacidade de medir os níveis de danos ao DNA inerentes ea resposta posterior reparação, o ensaio é altamente relevante parauma variedade de aplicações biológicas e clínicas. Informações sobre o impacto da exposição a produtos químicos específicos no genoma facilita a prevenção e tratamento da doença. Além disso, há também um interesse significativo em determinar as variações na sensibilidade do dano no DNA e capacidade de reparação entre indivíduos 23,24. Esta técnica proporciona o rendimento necessário para tais estudos em larga escala. O conhecimento sobre as variações inter-individuais é fundamental para identificar pessoas suscetíveis e para a concepção de terapias individualizadas ou estratégias de prevenções. Tomados em conjunto, a tecnologia aqui apresentada proporciona um elevado rendimento, plataforma objectivo e análise quantitativa de dano de ADN que tem o potencial para se tornar uma metodologia padrão no futuro próximo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiar principalmente por 5-UO1-ES016045 com apoio parcial do 1-R21-R44-ES019498 e ES021116. DMW foi apoiado pela Formação Grant NIEHS em Toxicologia Ambiental T32-ES007020. O equipamento foi fornecido pelo Centro de Ciências da Saúde Ambiental P30-ES002109.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
UltraPure LMP Agarose (low melting point) Invitrogen 16520 Multiple suppliers
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco by life technologies 14190 Multiple suppliers
Crystalline NaCl Macron Chemicals 7581-06 Multiple suppliers
Crystalline Na2EDTA Macron Chemicals 4931-04 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (base) Sigma-Aldrich T1503 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (acid) J.T.Baker 4106 Multiple suppliers
Crystalline N-lauroylsarcosine Sigma-Aldrich L9150 Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect
Crystalline NaOH Macron Chemicals 7708-06 Multiple suppliers, Corrosive
Hydrochloric acid VWR BDH3871 Multiple suppliers, Corrosive
Crystalline boric acid Sigma-Aldrich B6768 Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard
Name of Equipments Company Catalog Number Comments
CometChip Trevigen Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary
1-well dish Thomas Scientific 73521-420
Bottomless 96-wel plate VWR 655000-06
1.5″ binder clips Staples Multiple suppliers
Glass plate Tag Hardware Customized to size of 96-well plate
Owl Horizontal Electrophoresis System VWR 27372-131 Multiple suppliers
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050 Multiple suppliers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
  2. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
  3. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  4. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
  5. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
  6. Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
  7. Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
  8. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  9. Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
  10. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
  11. Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, 1-42 (2005).
  12. Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
  13. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
  14. McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
  15. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
  16. Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
  17. Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
  18. Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
  19. Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , (2010).
  20. Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
  21. Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
  22. Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
  23. Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
  24. Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).

Tags

DNA DamageComet AssayCometChipHigh-throughput96-well PlatformMicroarrayDNA Damaging AgentsGenotoxicity TestingDrug DevelopmentEpidemiological StudiesClinical Assays

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ge, J., Prasongtanakij, S., Wood, D. K., Weingeist, D. M., Fessler, J., Navasummrit, P., Ruchirawat, M., Engelward, B. P. CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells. J. Vis. Exp. (92), e50607, doi:10.3791/50607 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image