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Bioengineering

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

Published: October 18, 2014
doi:
10.3791/50607
, , , , , , ,
1Department of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology,Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering,University of Minnesota

Summary

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

Abstract

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Introduction

La electroforesis en gel de células individuales (SCGE) ensayo (también conocido como el ensayo cometa) es una técnica ampliamente utilizada para la cuantificación de un amplio espectro de lesiones del ADN, incluyendo lesiones de bases, sitios abásicos, roturas de cadena simple, doble filamento se rompe, entrecruzamientos y álcalis sensibles sitios. El principio subyacente del ensayo es que el ADN dañado migra más fácilmente que el ADN intacto debido a la fragmentación y pérdida de la estructura superhelical. El grado de migración es proporcional a la cantidad de daño en el ADN, y puede ser visualizado mediante microscopía de fluorescencia. -Captura de imágenes y análisis de perfil de intensidad de ADN en forma de cometa individuo luego entregar mediciones de parámetros tales como la longitud de la cola, momento de la cola, y el ADN% en cola para revelar el nivel de daño en el ADN dentro de una célula 1-4.

Actualmente hay dos versiones de uso común de la prueba del cometa: a) ensayo cometa alcalino y b) prueba del cometa neutral. El ensayo cometa alcalino es el más ampliamenteVersión usada, que utiliza un tampón de pH alto para descansar antes de la electroforesis de ADN y por lo tanto detecta todos los tipos de roturas de cadena y sitios sensibles al álcali. El ensayo cometa neutral, por otro lado, es menos practicado porque utiliza un tampón neutro para mantener las dobles hélices y detectar roturas de cadena doble sólo 2,5. Para agentes químicos y físicos que inducen DSBs, SSBs se crean en concierto, y se forman en niveles mucho más altos (por ejemplo, SSBs inducidos γIR son un orden de magnitud más común que las DSB). Para la mayoría de las exposiciones que dañan el ADN, DSB son mucho menos frecuentes que otras clases de daño en el ADN, y por lo tanto son más difíciles de detectar. Hemos demostrado en publicaciones anteriores la ventana de detección de ambas versiones. 6,7

Aunque el ensayo del cometa se ha utilizado de forma rutinaria para la investigación básica en el daño y reparación del ADN y pruebas de genotoxicidad 1,2,8-15, el ensayo se ha informado de que tiene mala reproducibilidad debido a la muestra-to-muestra, de persona a persona y la variabilidad entre laboratorios. Además, el ensayo es de bajo rendimiento, en parte debido a la adquisición de imágenes y análisis de datos son laboriosos. En conjunto, estas limitaciones contribuyen a su relativamente baja aceptación en estudios a gran escala. A través de la integración de tecnologías y principios de la ingeniería, la CometChip aporta una solución a los problemas de rendimiento y las inconsistencias que se asocian con el ensayo cometa tradicional 6,7. Brevemente, para crear el chip, un molde se microfabricado usando fotolitografía para crear microposts con diámetros tan pequeños como el de una sola célula. El molde se utiliza entonces para estampar en agarosa fundida, lo que resulta en una matriz de pocillos después de las gel solidifica. Las virutas se están desarrollando para proporcionar a los investigadores con los pozos de tamaño variable a su compatibilidad con distintos tipos de células. Para cargar el chip, las células en los medios de comunicación se dejan sedimentar en los pocillos por gravedad; el exceso de células son lavados. Atrapado células son luego nos encapsuladosing una fina capa de agarosa de bajo punto de fusión, y una placa de fondo 96 se sujeta entonces a la superficie del gel para crear macrowells 96, cada uno con cientos de micropocillos en su superficie inferior.

Este protocolo describe los procedimientos generales para los experimentos con este chip, que incluyen la preparación de gel, carga de las células, la dosificación y la reparación, la lisis celular, la electroforesis, y la imagen fluorescente. Demostramos dos ejemplos de experimentos de dosis-respuesta con células de linfoblastos expuestos agentes que dañan el ADN conocida, utilizando alcalina y versiones neutras del ensayo, respectivamente. Dos experimentos de reparación también se muestran para describir cómo respuesta de reparación después de la exposición puede ser evaluada utilizando el sistema.

Protocol

1 Preparación de la viruta Retire gel de chips del paquete y colóquela en un lado de la película una y placa rectangular, gel de abajo. Lavar gel en 25 ml de 1x PBS durante 15 minutos, repetir dos veces. Establecer gel en placa de vidrio y orientación de la etiqueta de gel en consecuencia. Presione suavemente una placa de 96 pozos sin fondo invertida en el gel; asegurarse de que todos los pocillos de la placa de fondo se encuentran dentro de la zona del gel. Utilice 1,5 '' clips de la carpeta en cada lado de la placa de sujeción para asegurar con el vidrio. Aspirar el exceso de tampón PBS en cada pocillo. 2. Cargando células Preparar suspensiones de células: Para las líneas celulares en suspensión, se diluye la suspensión de células en un medio para obtener una concentración final de 10 5 -10 6 células / ml. Para las líneas de células adherentes, siga / protocolos tripsinización desconexión de normales y dilute células desprendidas en los medios a una concentración final de 10 5 -10 6 células / ml. Si las células se agregan, pasar la suspensión de células en un filtro de células para obtener una suspensión de células individuales. Añadir 100 l de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Cubra el plato con la película de gel para evitar la evaporación de los medios de comunicación. Permiten a las células para cargar durante al menos 30 min en 37 ° C incubadora. Retire el chip de los medios de comunicación de la incubadora y aspirado de cada pocillo. Extraiga clips de la carpeta y placa de 96 pozos sin fondo; mantener el chip con la placa de cristal en un ángulo y enjuague suavemente con PBS 1x para eliminar el exceso de células en agarosa. Compruebe la carga de células usando un microscopio de campo claro con un lente objetivo de 4X. Si se observa la carga insuficiente, repita desde el paso 2.1. Coloque el chip cargado en una superficie plana (mesa de laboratorio). Chip de recubrimiento con un 1% de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa que es pre-calentado a 37 ° C. Utilice aproximadamente 2̵Se necesita 3 ml de agarosa LMP para cada chip; 1. Permitir superposición se solidifique primero a TA durante 3 min y luego pasar a 4 ° C refrigerador durante 5 min para la gelificación completa. 3. Dosificación y Reparación NOTA: Para el estudio de nivel de daño en el ADN de referencia, vaya al Paso 4. Alinee con cuidado los pocillos del chip (creado a partir de sujeción anterior) con los pocillos de una nueva placa de 96 pozos sin fondo. Presione nuevamente la placa de 96 pozos sin fondo de sujeción superior y seguro con clips de la carpeta. Añadir 100 l de química de dosis deseada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos; realizar la dosificación / tratamiento en hielo o en 4 ° C refrigerador por cantidad de tiempo deseada. Después de la dosificación, los productos químicos de aspirado de cada bien y enjuagar químico residual utilizando 1x PBS. Si se estudia el daño directo aquí, continúe con el Paso 4. Para estudiar la cinética de reparación, permitir que las células en el chip para reparar enlos medios de comunicación a 37 ° C. Lyse (continúe en el paso 4) en puntos de tiempo específicos. NOTA: La reparación se puede realizar en el chip con una placa de 96 pocillos sin fondo adjunto, o el chip puede ser cortado en piezas separadas después de la eliminación de la placa de 96 pocillos sin fondo. 4. Lisis Para realizar el ensayo cometa alcalino: Hacer trabajar tampón de lisis alcalina mediante la adición de 1% de Triton X-100 a alcalino solución de lisis de stock (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Preparar aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip. Pre-enfriamiento trabajando tampón de lisis alcalina a 4 ° C. Sumergir el chip en tampón de lisis alcalina de trabajo fresco y deje lisis para realizar O / N en 4 ° C refrigerador. Para realizar el ensayo cometa neutral: Hacer trabajar tampón de lisis neutro mediante la adición de 1% de Triton X-100 y 10% de DMSO a la solución de lisis de stock neutro (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Preparar aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip. Pre-caliente trabajando tampón de lisis neutral a los 43 ° C. Sumergir el chip en tampón de lisis neutral trabajo cálido y permitir la lisis para realizar O / N en el 43 ° C incubadora. 5. Electroforesis Para realizar el ensayo cometa alcalino: Retire tampón de lisis y rápidamente enjuague chip con 1x PBS. Seguro del chip en una cámara de electroforesis con el lado película de gel hacia abajo con cinta de doble cara. Llevar la cámara a un 4 ° C habitación fría. Llenar la cámara con tampón de electroforesis alcalina fría (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) a un nivel que sólo cubre el gel. Permitir la anulación alcalina durante 40 min. Ejecutar electroforesis a 1 V / cm y 300 mA durante 30 minutos en la sala de frío. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en el chamber para lograr actual que se ejecuta deseado. Para realizar el ensayo cometa neutral: Retirar el tampón de lisis y enjuague chip con tampón de electroforesis neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, ácido bórico 90 mM, pH 8,5) durante 2 x 15 min a 4 ° C. Seguro del chip en una cámara de electroforesis con el lado película de gel hacia abajo con cinta de doble cara. Llevar la cámara a un 4 ° C habitación fría. Llenar la cámara con tampón de electroforesis neutral fría (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5) a un nivel que sólo cubre el gel. Deje que el gel se sentara en la cámara fría durante 60 minutos. Ejecutar la electroforesis a 0,6 V / cm y 6 mA durante 60 minutos en la sala de frío. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseado. 6. Imaging fluorescente Retire el chip de la cámara de electroforesis de colsala d. Neutralizar los geles en tampón de neutralización (Tris 0,4 M, pH 7,5) durante 2 x 15 min en 4 ° C refrigerador. Teñir el chip con la tinción de ADN fluorescente de elección (es decir, Gold SYBR, bromuro de etidio) en fábrica procedimientos recomendados. Image usando microscopía fluorescente. Análisis 7. Datos Analizar cometa imágenes por software estándar de ensayo cometa como Komet 5.5.

Representative Results

En este primer ejemplo, se describe el enfoque para la cuantificación de los niveles iniciales de daño del ADN en las células linfoblastoides humanas después de la exposición al daño oxidativo usando H 2 O 2. Con el fin de evaluar H 2 O 2 inducida base lesiones y roturas de cadena simple, se utilizan condiciones cometa alcalino. Después de la carga es completa y las células se han encapsulado con la superposición de agarosa, se presiona una placa de 96 pocillos sin fondo sobre la superficie para crear 96-compartimientos en el chip. Cada uno de los 96 pocillos se puede dosificar con un tipo o concentración de los productos químicos diferentes. Aquí se utilizaron cuatro dosis diferentes de H 2 O 2 y 1x PBS se utilizó como control negativo. Imágenes representativas de los cometas dispuestos se muestran en la Figura 1A, donde no tratada (parte superior), 50 M (medio) y 100 M (abajo) H 2 O 2-expuestos muestras demostraron diferentes niveles de colas de los cometas. El análisis de las imágenes del cometa puede PERFORmed usando software disponible comercialmente, que generalmente cuantifica los niveles de daño sobre la base de la distancia total de la intensidad de fluorescencia y la migración de cada cola de cometa. Las mediciones se realizan comúnmente en 50 a 100 cometas por condición y el valor de la mediana (ya sea ADN de la cola% o longitud de la cola) se calcula. Figura 1B ilustra la curva de respuesta de ADN porcentaje cola analizado desde los TK6 cometas de células linfoblastoides expuestos a cuatro concentraciones diferentes de H 2 O 2. La consistencia entre experimentos independientes demuestra la eficacia de este enfoque en la evaluación de respuesta al daño en el ADN de varios niveles de tratamientos químicos en las células. Para aprender acerca de la variación entre las muestras (por ejemplo, entre macrowells) y entre repeticiones del mismo experimento, entre la muestra y la variabilidad inter-experimental se representan en la Figura 2A y 2B respectivamente. Dentro de cada experimento, cada pocillo de la de 96 wchip de ell es equivalente a una muestra diferente y por lo tanto la variación acomodado bien revela la variación entre muestras del dispositivo. Aquí, las células TK6 cargados en 12 pocillos de la viruta de 96 pocillos se trataron con la misma dosis de H 2 O 2 y se lisaron inmediatamente después del tratamiento. Todas las demás etapas experimentales se realizaron en paralelo y las medianas de al menos 50 cometas de cada macrowell se representaron gráficamente en la Figura 2A. El promedio de las medianas de ADN es 77,53% en la cola, con una desviación estándar es de 3,99%. A partir de estos datos, se calcula que el coeficiente de variación entre las muestras es de 5,2%, que es varias veces menor que el ensayo tradicional, lo que demuestra la mejora de la robustez de este ensayo de 6,16. Para obtener información sobre la reproducibilidad del ensayo, expusimos TK6 en un chip con 75 mM H 2 O 2 y analizamos el nivel inmediato de daño en el ADN. Este experimento se repitió seis veces y los datos de cada experimento se representan gráficamente en la Figura 2B. Bajo condiciones experimentales idénticas, se obtuvieron resultados que van desde 41,76% a 57,87%, que se muestra como barras grises en la figura. El promedio de seis repeticiones es 49,57%, con un error estándar de la media de sólo el 2,04%. La baja variación entre repeticiones implica que el ensayo cometa realizado sobre este nuevo dispositivo es altamente reproducible. Para evaluar la cinética de reparación, las células se les permite reparar su ADN en medio fresco después del tratamiento. Lisis macrowells en diversos puntos temporales revela el cambio en el daño del ADN en el tiempo. Un ejemplo se muestra en la Figura 3. En este experimento, se encapsularon células TK6 primero en el chip, se trataron con 50 mM H 2 O 2, y se dejaron para reparar hasta 60 min después de la exposición. Se lisaron las células a los 0, 20, 45 y 60 min respectivamente. Imágenes representativas de cometas en diferentes puntos temporales se muestran en la Figura 3A, y el cambio en los niveles de daño del ADN en el tiempo se trazan en la Figura3B. Estos datos revelaron que casi la totalidad de los daños es reparada dentro de 45 minutos después de H 2 O 2 tratamiento. Muchas variables pueden afectar la tasa de reparación, incluyendo el tipo de línea celular y el agente químico usado. De ahí que los investigadores pueden realizar modificaciones en el protocolo (es decir, se extiende el tiempo de reparación) para dar cabida a las necesidades adicionales en sus investigaciones. Aquí nos proporcionan otro ejemplo de experimento reparación utilizando este chip, en donde TK6 son desafiados con un agente genotóxico diferente N-metil-N '-Nitro- N nitrosoguanidina (MNNG) es un agente de alquilación se sabe que induce lesiones de base incluyendo 7-metilguanina y 3-metiladenina. Estas lesiones se convierten en sitios abásicos, ya sea por despurinación espontánea o por la eliminación enzimática de ADN glycosylases. El sitio abásico resultante se puede escindir en condiciones alcalinas y por lo tanto detecta en el chip. La exposición inicial provoca un aumento significativo en el daño, evidente a partir de la largacolas, y con el tiempo estas colas se reducen a medida que las células restauran ADN intacto durante la reparación. Aunque alquilación y el daño oxidativo son a la vez reparados principalmente por la vía de reparación por escisión de base, la cantidad de lesiones generadas y las proteínas implicadas en la reparación varían. Estas variaciones pueden dar lugar a diferentes tasas de conversión a sitios abásicos, así como diferentes tasas de reparación de los sitios abásicos resultantes. En la Figura 4, la cinética de reparación de las células TK6 expuestos a 0.1, 1, y se muestran 3 g / ml de MNNG. En este experimento, extendemos el tiempo experimento a 2 horas después de la exposición porque el daño inducido por MNNG parece persistir más tiempo y se borra a un ritmo más lento en comparación con el H 2 O 2 inducida por daños. Análisis de DSBs utilizando condiciones neutras es muy similar al protocolo para el análisis de las lesiones de una sola hebra usando las condiciones alcalinas. Para mostrar los niveles de daños iniciales, TK6 fueron expuestos a niveles variables de Gir, y las células resultantes se lisaron y se sometieron a electroforesis a un pH neutro (Figura 5A). Es de destacar que la morfología de las colas de los cometas es diferente de las condiciones de ensayo alcalinas. Para lograr ADN fragmentado observable utilizando este ensayo, la dosis IR utilizado es significativamente mayor (0-100 Gy) que la dosis requerida para ver el daño usando las condiciones alcalinas. Además, encontramos que la longitud de la cola es el parámetro más sensible para reflejar la extensión del daño de ADN cuando se utiliza el ensayo de cometa neutro 7. La curva de respuesta a la dosis analizada se ilustra en la Figura 5B. Reparación del ADN doble filamento se rompe en las células también se puede evaluar, y se ha demostrado por Weingeist et. al. 7. En conjunto, la CometChip neutral ofrece una valiosa herramienta para análisis de alto rendimiento de ADN DSBs. 1highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 1. H 2 O 2 dosis respuesta de las células TK6 utilizando ensayo cometa alcalino. (A) los cometas de pocillos en array de linfoblastos no tratados TK6 (parte superior) y TK6 expuestos a 50 M (medio) y 100 M (abajo) H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. La barra de escala es 100 m. (B) H 2 O 2 dosis-respuesta de las células TK6 expuestos a diversos niveles de H 2 O 2. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo la mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres experimentos independientes. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Inter-Muestra y el Inter-Experimental Variabilidad. (A) los cambios de muestra a muestra. TK6 de células de linfoblastos humanos se cargaron en 12 pocillos de la viruta 96 pocillos. Cada pocillo fue expuesto a 100 l de 50 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. Las células se lisaron y se ensayó para el ADN% de la cola inmediatamente. Los datos de cada pocillo se muestra aquí. Cada caja representa la mediana al menos 50 cometas individuales de cada pocillo. La media de 12 pozos es 77,53%, la desviación estándar es de 3,99%, y el coeficiente de variación se calcula para ser 5,2%. (B) variación-Experimento-con el Experimento. TK6 células linfoblásticas humanas fueron cargados en el chip de 96 pocillos, se expone a 100 l de 75 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. Las células se lisaron y se ensayó para el ADN% de la cola inmediatamente.El mismo experimento se repitió 6 veces y los datos de cada repetición se muestra como una barra gris. Cada caja representa la mediana de ADN% de cola de al menos 100 cometas individuales de cada repetición. El promedio de 6 repeticiones es 49.57%, que se muestra como la barra de nuevo aquí. La desviación estándar de 6 repeticiones es 4,99%, y el error estándar de la media se calcula para ser 2,04%, representado como la barra de error en la figura. Figura 3. Reparación de H 2 O 2 inducida por daño en linfoblastos TK6. (A) Esquema de estudio de reparación con los cometas representativas. TK6 se tratan con agentes que dañan y se dejan reparar en los medios de comunicación a 37 ° C antes de la lisis. (B) la cinética de reparación de las células TK6 después del tratamiento con 50 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 y #176; C. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo la mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de los experimentos repetidos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Reparación del daño inducido por MNNG en linfoblastos TK6. TK6 células se tratan con 0,1, 1 y 3 mg / ml MNNG durante 30 min a 4 ° C y se dejó para reparar en los medios a 37 ° C hasta 120 min después de la exposición. La mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales se obtuvo para cada uno de tres experimentos independientes. Las barras de error representan el error estándarde la media de tres experimentos independientes. Figura 5. Respuesta a la dosis de IR TK6 utilizando ensayo cometa neutral. (A) Vestida cometas micropocillos de linfoblastos no tratados TK6 (arriba) y TK6 expuestas a 40 Gy (mediana) y 80 Gy (abajo) la irradiación gamma. La barra de escala es 100 m. Respuesta a la dosis (B) IR de TK6 expuestos a diversos niveles de irradiación gamma. Cada punto de datos representa la longitud de la cola mediana (micras) de al menos 300 cometas agrupados de seis macrowells en el chip. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Genotoxinas ubicuas en el medio ambiente y también dentro de las células humanas ejercen estrés inevitable y daños en el ADN celular. De hecho, se ha estimado que hay 1.000 s de lesiones de ADN presentes en las células humanas en estado estacionario 18. La comprensión de la susceptibilidad al deterioro y la cinética de reparación en los seres humanos no sólo aporta conocimientos para la investigación básica, sino que también beneficia el desarrollo de fármacos. Irónicamente, a pesar de la capacidad de daño en el ADN para promover el cáncer, agentes que dañan el ADN se utilizan en niveles muy altos para tratar el cáncer, por lo que el conocimiento sobre el daño y reparación del ADN relevante a la medicina personalizada. El CometChip es un dispositivo de investigación novedosa que utiliza prácticas de microfabricación para revolucionar un ensayo de daño en el ADN-existencia prolongada. Sobre la base de los mismos principios de la prueba del cometa tradicional, el chip ofrece significativamente un mayor rendimiento y una mejor reproducibilidad. Se describen aquí métodos para el uso de este chip. Para aclarar su utilidad y robustez, mostramos los resultados de aquí para allám varios experimentos en los que el chip se ha utilizado para evaluar el daño inducido por varios agentes que dañan el ADN diferente, y donde se ha utilizado para evaluar la reparación del ADN. En conjunto, los resultados presentados aquí proporcionan información útil para utilizar el chip y demuestran su amplia aplicabilidad a la investigación sobre el daño y reparación del ADN.

Uno de los pasos más importantes en este protocolo es para llevar a cabo la carga de células eficaz. Muchas líneas celulares se han probado en este sistema, incluyendo tanto la suspensión y las células adherentes. Cargando la eficiencia depende de muchas variables tales como el tipo de células, el tamaño celular, la concentración de carga y el tiempo. Líneas celulares de suspensión como las células linfoblásticas son los más fáciles de trabajar. La concentración de la suspensión de células puede variar de 10 4 a 10 6 células por 96 pocillos y se carga generalmente se completa en 15-30 min. Mayor densidad celular facilita la carga y reduce la cantidad de tiempo necesario para que las células para resolver en los pocillos.

Cargando parámetros para células adherentes pueden diferir de las células en suspensión. Se han encontrado líneas celulares tales como ovario de hámster chino (CHO), para tener la eficiencia de carga similar a las células en suspensión (tras tratamiento con tripsina) y así utilizar las condiciones de carga similares. Otros tipos de células, tales como células tumorales que forman fácilmente agregados de células en suspensión, requieren una manipulación adicional. Pasando suspensiones de células a través de un filtro de una sola célula y la adición de tripsina a los medios de suspensión se puede suprimir la formación de grupos de células durante la carga. Finalmente, en términos de tiempo de carga, el tiempo requerido para la captura de líneas de células adherentes en micropocillos puede variar de 20 min a 1 h. Como resultado, se recomienda que los usuarios realizan experimentos piloto para determinar las condiciones de carga óptimas antes de proceder a nuevas investigaciones. Cargando eficacia puede ser visualizado bajo un microscopio de campo brillante o revelado por tinción con más precisión las células encapsuladas con DAPI u otro ADNmanchas antes de la evaluación bajo el microscopio de fluorescencia.

Una ventaja importante de este método y el chip es la versatilidad. En primer lugar, los investigadores no están restringidos a una concentración de células específicas de trabajo, porque el exceso de células se lavan, y el microarray asegura uniforme cometa densidad. En segundo lugar, los pocillos pueden hacerse con tamaños variables para adaptarse a los tipos de células de diferentes tamaños. En circunstancias que se capturan varias celdas en una sola microplaca, cometas de celdas multi-son resultados de auto-calibrado y rendimiento consistente en comparación con los cometas de una sola célula 6,7. Otro beneficio de las células modelando en una micromatriz es que todos los cometas son entonces en el mismo plano focal con posiciones fijas, lo que reduce el ruido debido a los cometas desenfocados y facilitar formación de imágenes y análisis automatizado. Las mejoras significativas en el rendimiento y la sensibilidad proporcionados por el CometChip permiten que la aplicación del ensayo para estudios a gran escala. Tomados en conjunto, el chip proporcionarsa herramienta valiosa para la evaluación de daños en el ADN para investigadores, toxicólogos, clínicos y epidemiólogos.

Si bien el ensayo cometa es conocido por su excelente sensibilidad en la detección de una amplia gama de daños en el ADN, este ensayo también sufre de baja especificidad. Usando este protocolo mejora en gran medida la reproducibilidad y el rendimiento del ensayo, pero no demuestra avance en la especificidad. Sin embargo, la multiplexación el ensayo con otras metodologías ha sido reportado para ser eficaz en la consecución de una mayor especificidad. Un ejemplo es la inclusión de enzimas purificadas específica de la lesión. Estas enzimas pueden convertir base lesiones de otro modo no detectables en roturas de la cadena detectables y sitios abásicos 1,19-21. Un ejemplo muy utilizado es la endonucleasa de reparación de ADN formamidopirimidina glicosilasa (FPG), que revela modificaciones del ADN oxidativo 19,22. Debido a la etapa de digestión enzimática se aplica después de la lisis celular, el sistema puede ser tratado de la misma manera que unsa tradicional de diapositivas de agarosa y sin alteraciones en el protocolo. Aunque el protocolo detallado no se describe aquí, este enfoque ha sido adoptado por muchos usuarios de ensayo de cometas tradicionales en el pasado y los protocolos se pueden encontrar fácilmente. En una publicación anterior, se utilizó este método para identificar el daño inducido por la luz fluorescente 22.

La principal ventaja de este método es el rendimiento que proporciona, que abre las puertas a los estudios que antes eran prácticamente imposible. La capacidad de procesar 96 muestras en la misma plataforma no sólo reduce la mano de obra y tiempo, sino que también reduce los ruidos experimentales y mejora en gran medida la reproducibilidad. Variación de la muestra Inter es significativamente menor que la tradicional variación de deslizamiento a la diapositiva, que puede ser 2 veces mayor que la variación observada con este chip 6,7. Reducción del ruido también conduce a la mejora de la sensibilidad, que permite la detección de las diferencias más sutiles entre las muestras. Debido a que el dispositivo emplea un staándar formato de 96 pocillos, es compatible con el equipo de investigación general y HTS tecnologías. Considere un estudio que requiere la evaluación de 100 muestras, suponiendo que un investigador promedio puede procesar ~ 30 portaobjetos de vidrio en el transcurso de varios días. Teniendo en cuenta que cada muestra debe realizarse por triplicado, se tardaría aproximadamente un mes para completar un estudio de este tipo, que también sufriría inevitablemente de una muestra a otra variación. En contraste, de procesamiento de 100 condiciones, cada uno por triplicado, con este chip requiere sólo unas pocas placas y se puede realizar en tres días. Esta importante mejora en el rendimiento se abre la puerta a los estudios que antes eran inalcanzables.

El protocolo que aquí se presenta describe tanto los procedimientos básicos para realizar el ensayo cometa estándar y los pasos modificados necesarios para utilizar la plataforma CometChip. Con la capacidad de medir tanto los niveles de daño de ADN inherentes y la respuesta posterior reparación, el ensayo es altamente relevante parauna variedad de aplicaciones biológicas y clínicas. La información sobre el impacto de la exposición a productos químicos específicos en el genoma facilita la prevención y tratamiento de enfermedades. Además, también existe un interés significativo en la determinación de variaciones en la sensibilidad daño del ADN y la capacidad de reparación entre los individuos 23,24. Esta técnica proporciona el rendimiento requerido para tales estudios a gran escala. El conocimiento de las variaciones inter-individuales es fundamental para la identificación de personas susceptibles y para el diseño de terapias individualizadas o estrategias prevenciones. En conjunto, la tecnología que aquí se presenta ofrece un alto rendimiento, plataforma de análisis de daño en el ADN objetiva y cuantitativa que tiene el potencial para convertirse en una metodología estándar en un futuro próximo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo se apoya fundamentalmente en un 5-UO1-ES016045 con apoyo parcial de 1-R21-R44-ES019498 y ES021116. DMW fue apoyado por el subsidio de estudios del NIEHS en Toxicología Ambiental T32-ES007020. Equipo fue proporcionada por el Centro de Ciencias de la Salud Ambiental P30-ES002109.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
UltraPure LMP Agarose (low melting point) Invitrogen 16520 Multiple suppliers
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco by life technologies 14190 Multiple suppliers
Crystalline NaCl Macron Chemicals 7581-06 Multiple suppliers
Crystalline Na2EDTA Macron Chemicals 4931-04 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (base) Sigma-Aldrich T1503 Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (acid) J.T.Baker 4106 Multiple suppliers
Crystalline N-lauroylsarcosine Sigma-Aldrich L9150 Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect
Crystalline NaOH Macron Chemicals 7708-06 Multiple suppliers, Corrosive
Hydrochloric acid VWR BDH3871 Multiple suppliers, Corrosive
Crystalline boric acid Sigma-Aldrich B6768 Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard
Name of Equipments Company Catalog Number Comments
CometChip Trevigen Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary
1-well dish Thomas Scientific 73521-420
Bottomless 96-wel plate VWR 655000-06
1.5″ binder clips Staples Multiple suppliers
Glass plate Tag Hardware Customized to size of 96-well plate
Owl Horizontal Electrophoresis System VWR 27372-131 Multiple suppliers
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050 Multiple suppliers
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Ge, J., Prasongtanakij, S., Wood, D. K., Weingeist, D. M., Fessler, J., Navasummrit, P., Ruchirawat, M., Engelward, B. P. CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells. J. Vis. Exp. (92), e50607, doi:10.3791/50607 (2014).
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