CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed
Summary
وصفنا هنا منصة تسمح الكشف مقايسة المذنب الحمض النووي من التلف مع سرعة غير مسبوقة. أنماط جهاز خلايا الثدييات في ميكروأري وتمكن المعالجة المتوازية من 96 عينات. النهج يسهل تحليل الحمض النووي من التلف مستوى القاعدة، التي يسببها التعرض للضرر وإصلاح الحمض النووي DNA حركية.
Abstract
DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.
Introduction
وهلام الكهربائي خلية واحدة (SCGE) فحص (الملقب الفحص المذنب) هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقدير حجم مجموعة واسعة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك الآفات القاعدة، مواقع abasic، فواصل حبلا واحدة، فواصل حبلا مزدوجة، crosslinks والقلويات حساسة المواقع. مبدأ الكامنة وراء الفحص هو أن تلف الحمض النووي يهاجر بسهولة أكبر من الحمض النووي غير التالفة بسبب التشرذم وفقدان هيكل superhelical. مدى الهجرة يتناسب مع كمية من الحمض النووي من التلف، ويمكن تصور باستخدام المجهر مضان. التقاط الصور وتحليل الشخصية شدة DNA على شكل المذنب الفردي ثم تقديم القياسات المعلمة مثل طول الذيل، والذيل لحظة، وDNA٪ في الذيل للكشف عن مستوى الضرر الحمض النووي داخل الخلية 1-4.
حاليا هناك نسختين تستخدم عادة للمقايسة المذنب: أ) فحص القلوية المذنب وب) مقايسة المذنب محايد. فحص القلوية المذنب هو الأكثر انتشاراالنسخة المستخدمة، والذي يستخدم منطقة عازلة درجة الحموضة العالية للاسترخاء DNA قبل الكهربائي وبالتالي بالكشف عن جميع أنواع فواصل حبلا والقلويات مواقع حساسة. الفحص المذنب محايد، من ناحية أخرى، هو أقل متمرسة لأنه يستخدم عازلة محايد للحفاظ على اللوالب المزدوجة وكشف الوحيدة فواصل حبلا مزدوجة 2،5. الكيميائية والعوامل المادية التي تحفز DSBs، يتم إنشاء SSBS في الحفل، وتتشكل عند مستويات أعلى بكثير (على سبيل المثال، SSBS γIR التي يسببها هي أمر من حجم أكثر شيوعا من DSBs). بالنسبة لمعظم التعرض الضارة DNA، DSBs هي أقل تواترا بكثير من فئات أخرى من الحمض النووي من التلف، وبالتالي هي أكثر صعوبة للكشف. لقد أثبتنا في المنشورات السابقة نافذة الكشف عن كلا الإصدارين. 6،7
على الرغم من أن مقايسة المذنب قد استخدمت بشكل روتيني للبحوث الأساسية على الحمض النووي من التلف وإصلاح واختبار السمية الوراثية 1،2،8-15، تم الإبلاغ عن الفحص وجود الفقراء بسبب استنساخ عينة ل-عينة، من شخص إلى شخص وتقلب المختبر إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو انخفاض الإنتاجية، وذلك جزئيا بسبب الحصول على الصور وتحليل البيانات وشاقة. معا، تساهم هذه القيود لها لقبول منخفض نسبيا في الدراسات على نطاق واسع. من خلال دمج تقنيات ومبادئ الهندسة، وCometChip يجلب حلا لمشاكل إنتاجية والتناقضات التي ترتبط مع المذنب الفحص التقليدي 6،7. لفترة وجيزة، لإنشاء رقاقة، وmicrofabricated قالب باستخدام ضوئيه لخلق microposts بأقطار صغيرة مثل التي من خلية واحدة. ثم يتم استخدام القالب للقضاء على الاغاروز المنصهر، مما أدى إلى مجموعة من microwells بعد يتصلب هلام. ويجري حاليا وضع رقائق لتوفير الباحثين مع الآبار متغير الحجم لتتوافق مع أنواع مختلفة من الخلايا. لتحميل رقاقة، ويسمح للخلايا في وسائل الإعلام لتسوية في الآبار عن طريق الجاذبية. يتم غسلها الخلايا الزائدة بعيدا. خلايا المحاصرين ثم يتم تغليف لناجي طبقة رقيقة من نقطة انصهار منخفضة الاغاروز، ومن ثم فرضت في قعر 96 لوحة جيدا على سطح هلام لخلق 96 macrowells، ولكل منها مئات microwells على سطحه السفلي.
يصف هذا البروتوكول والإجراءات العامة لإجراء التجارب مع هذه الشريحة، والتي تشمل إعداد هلام، تحميل خلية، الجرعات وإصلاح، تحلل الخلية، الكهربي، والتصوير الفلورسنت. نحن لشرح مثالين من التجارب الاستجابة للجرعة مع الخلايا lymphoblast يتعرض كلاء ضررا الحمض النووي المعروف، وذلك باستخدام قلوية والإصدارات محايدة للمقايسة على التوالي. وتظهر تجربتين إصلاح أيضا لوصف كيف يمكن تقييم استجابة إصلاح بعد التعرض باستخدام نظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
genotoxins في كل مكان في البيئة وأيضا داخل الخلايا البشرية تمارس الضغط لا مفر منه وتلف الحمض النووي الخلوي. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن هناك 1،000s من آفات الحمض النووي الموجودة في الخلايا البشرية في حالة مستقرة 18. فهم الضرر قابلية وحركية الإصلاح في البشر ليس فقط يجلب البصيرة إلى البحوث الأساسية، ولكن أيضا فوائد تطوير الأدوية. ومن المفارقات، على الرغم من قدرة الحمض النووي من التلف لتعزيز السرطان، وتستخدم وكلاء ضررا DNA عند مستويات مرتفعة جدا لعلاج السرطان، مما يجعل المعرفة عن الحمض النووي من التلف وإصلاح ذات الصلة الطب الشخصي. وCometChip هو جهاز البحوث الرواية التي تستخدم ممارسات التصنيع الدقيق للثورة وكانت موجودة منذ فترة طويلة فحص الحمض النووي من التلف. بناء على نفس مبادئ الفحص المذنب التقليدي، يوفر رقاقة أعلى بكثير الإنتاجية وتحسين التكاثر. وصفنا هنا طرق لاستخدام هذه الشريحة. لتوضيح فائدتها ومتانة، وتبين لنا النتائج جيئة وذهابام العديد من التجارب حيث تم استخدام رقاقة لتقييم الأضرار الناجمة عن عدة عوامل ضارة DNA مختلف، وحيث تم استخدامه لتقييم إصلاح الحمض النووي. معا، والنتائج المقدمة هنا توفر معلومات مفيدة لاستخدام رقاقة وتظهر إمكانية تطبيقه على نطاق واسع لبحث الحمض النووي من التلف والإصلاح.
واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هو إنجاز الفعلي لتحميل الخلية. وقد تم اختبار العديد من خطوط الخلايا على هذا النظام، بما في ذلك تعليق والخلايا الملتصقة. تحميل كفاءة يعتمد على العديد من المتغيرات مثل نوع من الخلايا، حجم الخلية، وتركيز التحميل والوقت. خطوط الخلايا مثل الخلايا تعليق lymphoblastoid هي أسهل للعمل مع. تركيز تعليق خلية يمكن أن تتفاوت من 10 أبريل – 10 يونيو خلايا في 96 جيدا وتحميل يكمل عادة في 15-30 دقيقة. كثافة الخلية أعلى تسهل التحميل ويقصر مقدار الوقت اللازم للخلايا ليستقر في microwells.
يمكن تحميل المعلمات للخلايا ملتصقة تختلف من خلايا تعليق. تم العثور على خطوط الخلايا مثل الصينية الهامستر المبيض (CHO) خلايا، لديك كفاءة مماثلة تحميل كخلايا تعليق (trypsinization التالية)، وبالتالي استخدام ظروف التحميل مماثلة. أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا السرطانية التي تشكل بسهولة المجاميع خلية في التعليق، وتتطلب معالجة إضافية. يمكن تمرير تعليق خلية من خلال مرشح وحيد الخلية وإضافة التربسين إلى وسائل الإعلام تعليق قمع تشكيل مجموعات الخلايا أثناء التحميل. أخيرا، من حيث وقت التحميل، والوقت اللازم لالتقاط خطوط الخلايا الملتصقة في microwells يمكن أن تتفاوت من 20 دقيقة إلى 1 ساعة. ونتيجة لذلك، فمن المستحسن أن المستخدمين إجراء التجارب الرائدة لتحديد ظروف التحميل الأمثل قبل الشروع في مزيد من التحقيقات. يمكن تصور فعالية تحميل تحت المجهر حقل مشرق أو كشف أكثر دقة عن طريق تلطيخ الخلايا مغلفة مع دابي أو DNA الآخرينالبقع السابقة للتقييم تحت المجهر الفلورسنت.
واحد الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي رقاقة وبراعة. أولا، لا تقتصر الباحثين إلى تركيز خلية عمل معين لأن الخلايا الزائدة وجرفت، وميكروأري يضمن موحدة المذنب الكثافة. ثانيا، يمكن جعل microwells مع أحجام متغيرة لاستيعاب أنواع الخلايا ذات أحجام مختلفة. في ظل الظروف التي يتم التقاطها خلايا متعددة في microwell واحد، المذنبات متعددة الخلايا هي النتائج متسقة معايرة الذاتي والعائد بالمقارنة مع المذنبات وحيدة الخلية 6،7. فائدة أخرى من الزخرفة الخلايا في ميكروأري هي أن جميع المذنبات هي ثم في نفس المستوى البؤري مع مواقع ثابتة، والحد من الضوضاء بسبب المذنبات غير مركزة وتسهيل التصوير والتحليل الآلي. تمكن تحسينات كبيرة في الإنتاجية والحساسية التي تقدمها CometChip تطبيق الفحص للدراسات واسعة النطاق. أخذت معا، ورقاقة توفيرسا أداة قيمة لتقييم الأضرار الحمض النووي للباحثين وعلماء السموم والأطباء وعلماء الأوبئة.
بينما يتم الفحص المذنب المعروف حساسية ممتازة في الكشف عن مجموعة واسعة من الحمض النووي من التلف، يعاني هذا الاختبار أيضا من انخفاض خصوصية. باستخدام هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير استنساخ والإنتاجية للمقايسة، ولكنها لا تثبت التقدم في خصوصية. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن مضاعفة فحص مع منهجيات أخرى لتكون فعالة في تحقيق أعلى خصوصية. ومن الأمثلة على ذلك إدراج تنقية الانزيمات آفة محددة. هذه الانزيمات يمكن تحويل قاعدة الآفات لا يمكن اكتشافها إلا في فواصل حبلا اكتشافها ومواقع abasic 1،19-21. والمثال استخداما هو إصلاح الحمض النووي نوكلياز داخلية formamidopyrimidine glycosylase (FPG)، الذي يكشف عن تعديلات الحمض النووي الأكسدة 19،22. لأنه يتم تطبيق الخطوة انزيم الهضم بعد تحلل الخلية، يمكن للنظام أن يعامل بنفس الطريقةسا الشريحة الاغاروز التقليدية دون إجراء أي تعديلات على البروتوكول. على الرغم من أن بروتوكول مفصلة لم يتم وصفه هنا، وقد تم تكييف هذا النهج من قبل العديد من المستخدمين مقايسة المذنب التقليدي في الماضي والبروتوكولات يمكن العثور بسهولة. في منشور السابق، استخدمنا هذا الأسلوب لتحديد الفلورسنت التي يسببها ضوء الضرر 22.
والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يوفر الإنتاجية، والذي يفتح الأبواب للدراسات التي كانت في السابق مستحيلا. القدرة على معالجة 96 عينة على نفس المنصة لا يقلل فقط من العمل والوقت، ولكن أيضا يقلل من الضوضاء التجريبية، ويعزز إلى حد كبير استنساخ. تباين عينة أمور أقل بكثير من التباين التقليدي شريحة إلى الشريحة، التي يمكن أن تكون 2 أضعاف أعلى من التباين وحظ مع هذه الشريحة 6،7. يؤدي خفض الضوضاء أيضا في تحسين حساسية، مما كشف عن الاختلافات أكثر دهاء بين العينات. لأن الجهاز يعمل على ستاndard شكل 96 جيدا، وهو متوافق مع المعدات البحثية العامة وHTS التكنولوجيات. النظر في الدراسة التي تتطلب تقييم 100 عينة، على افتراض أن متوسط الباحث يمكن معالجة ~ 30 الشرائح الزجاجية على مدار عدة أيام. وبالنظر إلى أن كل عينة تحتاج إلى أن يؤديها في ثلاث نسخ، ان الامر سيستغرق نحو شهر لاستكمال هذه الدراسة، التي من شأنها أيضا تعاني حتما من عينة لعينة الاختلاف. في المقابل، معالجة 100 حالة، كل في ثلاث نسخ، مع هذه الشريحة تتطلب سوى بضع لوحات، ويمكن أداؤها في ثلاثة أيام. هذا تحسن كبير في الإنتاجية يفتح الباب أمام الدراسات التي كانت سابقا غير قابلة للتحقيق.
بروتوكول المعروضة هنا يصف كل من الإجراءات الأساسية لإجراء الفحص المذنب القياسية والخطوات اللازمة لتعديل استخدام منصة CometChip. مع القدرة على قياس كل المتأصلة مستويات الحمض النووي من التلف والرد إصلاح اللاحقة، والاختبار هو ذات أهمية كبيرة لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية والسريرية. معلومات عن تأثير التعرض للمواد الكيميائية المحددة على الجينوم تسهل الوقاية من الأمراض والعلاج. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا اهتمام كبير في تحديد الاختلافات في الحمض النووي الضرر الحساسية والقدرة على إصلاح بين الأفراد 23،24. توفر هذه التقنية سرعة نقل المطلوب لمثل هذه الدراسات على نطاق واسع. المعرفة حول الاختلافات بين الأفراد هو أمر حاسم لتحديد الأشخاص المعرضين لتصميم وعلاجات فردية أو استراتيجيات المنع. أخذت معا، والتكنولوجيا المقدمة هنا توفر إنتاجية عالية وموضوعية وكمية منصة تحليل الحمض النووي من التلف الذي لديه القدرة على أن تصبح منهجية موحدة في المستقبل القريب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل في المقام الأول 5 UO1-ES016045 بدعم جزئي من 1-R21-R44-ES019498 وES021116. وأيد DMW من التدريب غرانت علوم الصحة البيئية في علم السموم البيئية T32-ES007020. تم توفير المعدات من قبل مركز علوم الصحة البيئية P30-ES002109.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| Name of Equipments | Company | Catalog Number | Comments |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-wel plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5″ binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
