Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu
Summary
Fermantörler biyomühendislik hücrelerinin kültür verim ve verimliliği artırmak için kullanılır. Çalkalama şişelerinde birden fazla mikrobiyal ya da hayvan hücre kültürü aday tarama sonra, bir sonraki mantıksal aşama fermantöre Seçilen kültürün biyokütle artırmaktır. Bu video, tipik bir tezgah üstü biyoreaktör sisteminin kurulumunu ve çalışmasını gösterir.
Abstract
Fermentasyon sistemleri hücre kültürleri çok farklı türleri için uygun bir büyüme ortamı sağlamak için kullanılır. Dikkatli sıcaklık, pH ve özellikle çözünmüş oksijen konsantrasyonunu kontrol etmek için mayalama sağladığı yeteneği etkili büyük ölçekli büyümesi ve fermantasyon ürünlerinin ifadesinin onları gerekli kılar. Bu video kısaca sallama şişesi üzerinde, fermentöre avantajlarını anlatacağız. Aynı zamanda tipik bir tezgah üstü fermantasyon sisteminin önemli bileşenlerini belirlemek ve sondaları, geminin ve kalibrasyon kurulumu hakkında temel eğitimi verecek. Izleyici, sterilizasyon işlemi ile aşina ve kültür ile, kap içindeki büyüme ortamı aşılamak için nasıl gösterilir. Operasyon, örnekleme, ve hasat temel kavramlar da gösterilecektir. Basit veri analizi ve sistem temizleme da ele alınacaktır.
Introduction
Temel Teknoloji fermantasyon kültür üretmek için basit bir çalkalama şişesi tekniğinin bir uzantısıdır. Bu daha tam ve nicel bir şekilde canlı kültürleri için büyüme ortamları kontrol etmek arzusu büyümüştür. Toplu kültür çalkalama şişeleri genellikle sıcaklığın kesin kontrolü ile sınırlıdır. Bir kuluçkaya çalkalayıcı veya sıcak bir odada sıcaklık tekdüzelik bazen 5 ° C ayrılmanın veya amaçlanan set daha, çok değişkendir. Çalkalama şişesi, normal olarak sabit bir hızda çalkalanmıştır olduğu için, oksijen kullanımı ve gaz değişimi sınırlıdır. Mevcut ortam oksijen bitince, çoğu kültürde gelişmek için başarısız. Çalkalama şişelerinde hiç bir pH kontrolü yoktur. Kültür besleme stoku ile sınırlı değilse, bir çok durumda, bu kültüre zarar noktasına asidik hale gelir ve solunum önemli ölçüde yavaşlatır. En çalkalama balonu kültürleri ayrıca inoculatio ya da kültürlerin başlangıcında yakınında sadece bir kez beslenir anlamına gelen bir "yığın" olarak çalıştırılırn. Bu ilk karbon kaynağı tüketildikten sonra, kültür büyüme durur. Bazı durumlarda metabolizması kayması ve kültür et suyu içinde başka metabolitleri tüketmeye başlar, bazen edilen biyokütle veya proteinin özelliklerini değiştirmek olabilir. Çalkalama şişelerinde aynı zamanda 37 ° C 'de sıcak bir kültür ortamı, 24 saat başına hacim, tipik olarak% 10 in ortam buharlaştıncı kaybı genellikle tabidir Bu kayıp kültürünün yoğunluğunu değiştiren ve sistemin uzun süreli çalışmasını engeller. Son olarak, kullanıcının çalkalama sonra ortamdan köpük karşılaşabilir. Yukarıdaki kültür üst kısmında bir köpük oluşumu gaz değişimi ve bundan başka genu büyümesini sınırlar.
Temel fermantasyon sistemi bu sınırlamalar tüm çözmek için tasarlanmıştır. Dikkatli sıcaklık kontrolü pervane çalkalama ve bir ısıtma ceketi kullanımı ile fermantasyon damarları elde edilir. Genellikle bu ceket ısıtma ve soğutma kabı ve geri besleme kontrolü içine yerleştirilen sensorset etrafında ± 0.1 ° C sıcaklık kontrolü sonuçları. Benchtop fermante genellikle bir pompa aracılığıyla sıvı reaktif madde ilave edilerek pH kontrolü sağlar. PH değeri sürekli hücre büyümesi için ortam optimum tutmak için bir çaba olarak izlenir. Uygun havalandırma belirtilen karıştırma pervane tarafından veya doğrudan kültür içine hava veya oksijen ilave gaz infüzyonu ile muhafaza edilmektedir. Kesme duyarlı kültürleri ile, oksijen takviye gaz kültüründe oksijen seviyesinin bakım için ana mekanizmadır. Solüsyonu içinde oksijenin ölçümü, genellikle çalkalama şişelerinde kullanım için normal olarak mevcut olmayan bir polarografik sonda ile elde edilir. Bu, sürekli veya periyodik olarak, bir doğrusal ya da lineer olarak bir büyüme sağlamak için kaba yem ilave etmek de mümkündür. Çıkış gazı kondansatör ve böylece kültür hacmi ve yoğunluk koruyarak aktarmak egzoz gazı akışında buhar için soğuk bir yüzey sağlar. Köpük önleyici yüzey aktif periyodik olarak ek çalıştırılırYüzeyde köpük azaltılması ve gaz alışverişini sağlayan kültüründe bir iletkenlik probu ile.
Bu kap, her probları ile, bağlantı parçaları, fanlar, hasat borular ve tüpler, monte edilir ve standart bir otoklavda sterilize edilir. Nihai prob kalibrasyon ve çalışma ortamı için istikrar sonra, kültür kabına ilave edilir. Sistem daha sonra bir çalkalama şişesi yöntemi ile daha nicel ve hassas bir şekilde kültür karakterize etmek için kullanılabilir. Sıcaklık, pH, oksijen içeriği, yem tüketimi, sıvı buharlaştırma ve köpük seviyeleri arasında sıkı kontrol tüm çok daha yüksek bir biyokütle ve daha iyi bir protein verimi katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karıştırılan tank reaktörler Biyoteknoloji sektöründe standart ve 40 yıldır 1 süredir kullanılmaktadır. Küçük karıştırılan tank ölçekli-up, küçültülmesi, gerginlik optimizasyonu, karakterizasyonu ve süreç geliştirme için önemli olmuştur. Ayrıca, bireyselleştirilmiş tıp 2 gelişiminde önemli bir role sahip olabilir. Bu, izlenmekte ve çalışma boyunca optimize edilebilir, çünkü küçük ölçekli biyo-reaktörü hücre büyümesi için in situ koşullarında en benzer. Çoğu zaman, ilk deneyler, çalkalama şişeleri içinde gerçekleştirilir, ancak küçük ölçekli biyoreaktörde koşullar sallama şişesi önemli ölçüde farklıdır. Bir deney içinde bulduğumuz E optimal büyüme koşulları coli ve sallama şişesi içinde yeşil floresan protein (GFP) üretimi karıştırma deposu (yayınlanmamış veriler) çevirmek değildi.
Büyük ölçekte gelişen hücrelerin diğer yöntemler silindir şişe, tek bir u içerirse Her yöntem 50 5.000 L. çalışma hacmi ile platformu Reaktörler 3 ve daha büyük tek kullanımlık Reaktörler sallanan ölçek kadar zorlukları sağlar, ancak üretimde bir yer bulmuştur. Platform biyoreaktör sallanan tek kullanım karıştırma deposu benzer ve düzenli bir ortam sağlar. Bu hücre çökmesini önlemek ve oksijen sağlamak için dalgaları üretmek nedeniyle sallanan bir hareket oluşur karıştırma karıştırma deposu farklıdır. Bu yöntem için hidrodinamik karıştırma deposu farklıdır ve en fazla hacim farklılıkları, hücre büyümesini ve ürün üretimini etkileyebilir 1000 L ile sınırlıdır bulunmaktadır. Diğer tek kullanımlık sistemleri, altyapı ve ilişkili yükü minimum bir platform sağlamak için tek reaktör ile karıştırılır tankı birleştirmek ve yüksek verimlilik için yeteneği 4 Biyoişleme.
Benchtop Biyoreaktörler Yeni kullanıcılar sorun pH, PO 2 ve tem ilk ayar noktalarını belirleyen olabilirken, ancak yayımlanan araştırma, bu bilgi 5, 6, 7, 8, 9 için başvurulabilir. Özellikle bakteri kültürleri ile, bir çalkalama şişesinde ve aynı set sıcaklık olarak aynı hızda çalkalama başlatmak için tavsiye edilir. Önceki shake flasks çalıştırmasının Kültür pH değeri, aynı zamanda bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. PO2 değeri ayarı daha zordur ve genellikle ampirik olarak belirlenir. Ancak,% 50 pO 2 ile başlayan tavsiye edilen başlangıç noktasıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Johns Hopkins Üniversitesi, Ağ Geçidi Bilim Girişimi aracılığıyla Provost Ofisi tarafından kısmen destek oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
