Fonctionnement d'un bioréacteur de laboratoire
Summary
Fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules transgéniques. Après le dépistage multiples microbiennes ou animales candidats de culture de cellules dans des flacons agités, la prochaine étape logique est d'augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre l'installation et le fonctionnement d'un système de bioréacteur de paillasse typique.
Abstract
Les systèmes de fermentation sont utilisés pour fournir un environnement optimal pour la croissance de nombreux types de cultures de cellules. La possibilité offerte par des fermenteurs de contrôler avec soin la température, le pH et les concentrations en oxygène dissous, en particulier, les rend indispensables à la croissance à grande échelle efficace et l'expression de produits de fermentation. Cette vidéo décrire brièvement les avantages de la cuve de fermentation au cours de la fiole d'agitation. Il permettra également d'identifier les éléments clés d'un système de fermentation de paillasse typique et donner des instructions sur la configuration de base de la cuve et l'étalonnage de ses sondes. Le spectateur sera familiarisé avec le procédé de stérilisation et montré comment inoculer le milieu de croissance dans le récipient de culture. Les concepts de base de fonctionnement, l'échantillonnage et la récolte seront également démontrés. Analyse de données simple et nettoyage du système seront également discutées.
Introduction
La technologie de fermentation de base est une extension de la technique simple de flacon d'agitation pour cultures en croissance. Il est né de la volonté de contrôler les environnements de croissance pour cultures vivantes d'une manière plus complète et quantitative. Lot flacons culture d'agitation sont généralement limitées par le contrôle de la température imprécise. Uniformité de la température dans un shaker incubés ou salle chaude est très variable, parfois s'égarer 5 ° C ou plus de la valeur de consigne destinée. Etant donné que le flacon d'agitation est généralement agité à une vitesse fixe, la consommation d'oxygène et de gaz d'échange est limité. Une fois l'oxygène ambiant disponible est épuisé, la plupart des cultures ne parviennent pas à se développer. Il n'ya pas de contrôle du pH dans des flacons agités. Dans de nombreux cas, si la culture n'est pas limitée par la charge d'alimentation, il devient acide au point de nuire à la culture et la respiration ralentit considérablement. La plupart des cultures en flacons agités sont également fonctionner comme un «lot», ce qui signifie qu'ils sont alimentés seulement une fois au niveau ou à proximité du début des cultures inoculation. Après cette source de carbone initiale est consommée, la culture cesse de croître. Dans certains cas, son métabolisme peut changer et commencer à consommer d'autres métabolites dans le bouillon de culture, parfois de modifier les caractéristiques de la biomasse ou de la protéine résultante. des flacons d'agitation sont aussi généralement soumis à des médias perte par évaporation dans des environnements de culture plus chaudes, généralement 10% du volume par 24 heures à 37 ° C. Cette perte change la densité de la culture et interdit un fonctionnement plus long terme du système. Enfin, l'utilisateur peut rencontrer moussant des médias après l'agitation. L'apparition de mousse dans le vide au-dessus de la culture permettra de limiter les échanges gazeux et la croissance du grasset.
Le système de fermentation de base est conçu pour répondre à toutes ces limitations. Contrôle soigneux de la température est réalisée dans des cuves de fermentation par l'utilisation de la turbine d'agitation et d'une enveloppe chauffante. Capteur inséré dans le récipient et les informations de contrôle de chauffage et de refroidissement de cette enveloppe habituellementrésultats dans le contrôle de la température ± 0,1 ° C autour de la consigne. Fermenteurs de paillasse fournissent généralement un contrôle de pH par addition de réactif liquide par une pompe. La valeur du pH est contrôlée en permanence dans le but de maintenir un environnement optimal pour la croissance cellulaire. Une bonne aération est maintenue par l'impulseur de mélange mentionné ci-dessus ou par l'injection d'air ou d'oxygène gazeux additionné directement dans la culture. Avec des cultures sensibles au cisaillement, de l'oxygène gazeux additionné est le principal mécanisme de maintien de niveau d'oxygène dans la culture. La mesure de l'oxygène dans la solution est généralement obtenue par une sonde polarographique qui n'est pas normalement disponible pour une utilisation dans des flacons agités. Il est également possible d'ajouter en continu ou périodiquement dans la cuve d'alimentation pour maintenir la croissance de manière linéaire ou exponentielle. Le condenseur de gaz de sortie fournit une surface froide de la vapeur dans le flux de gaz d'échappement pour condenser, préservant ainsi le volume de la culture et de la densité. Addition périodique d'agent tensio-actif antimousse est actionnéepar une sonde de conductivité dans la culture, la réduction de la mousse sur la surface et en permettant l'échange de gaz.
Le navire, avec toutes les sondes, raccords, roues, tuyaux de récolte, et des tubes, est assemblé et stérilisé dans un autoclave standard. Après l'étalonnage de la sonde et de la stabilisation définitive de l'environnement d'exploitation, la culture est introduite dans le récipient. Le système peut alors être utilisé pour caractériser la culture d'une manière qui est plus quantitative et précise qu'avec un procédé par agitation du flacon. Un contrôle strict de la température, le pH, la teneur en oxygène, la consommation de nourriture, l'évaporation du liquide, et les niveaux de mousse contribuent tous à une biomasse bien plus élevée et un meilleur rendement en protéines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioréacteurs à cuve agitée sont la norme dans l'industrie de la biotechnologie et ont été utilisés depuis plus de 40 ans 1. La petite cuve agitée a été important pour l'échelle, à échelle réduite, l'optimisation de la souche, la caractérisation et le développement de processus. Elle peut aussi avoir un rôle important dans le développement de la médecine individualisée 2. Le bioréacteur à petite échelle est la plus semblable à des conditions in situ de la croissance de la cellule, car il peut être contrôlé et optimisé tout au long de la course. Le plus souvent, des expériences initiales sont effectuées en utilisant des flacons d'agitation, mais les conditions dans le bioréacteur à petite échelle diffèrent de manière significative de la fiole d'agitation. Dans une expérience, nous avons trouvé que les conditions pour une croissance optimale de E. coli et à la production de la protéine fluorescente verte (GFP) dans le flacon d'agitation ne se traduisent pas sur le bac à agitation (données non publiées).
D'autres méthodes de croissance de cellules à grande échelle comprennent des bouteilles à rouleaux, seul use bascule bioréacteurs de la plate-forme 3 et grands bioréacteurs à usage unique avec des volumes de travail de 50 à 5000 L. Chaque méthode fournit des défis à l'échelle supérieure, mais a trouvé une place dans la production. L'utilisation seule plate-forme à bascule bioréacteur est similaire à la cuve agitée, et fournit un environnement régulé. Elle diffère de la cuve agitée en ce que le mélange se produit en raison d'un mouvement de bascule pour générer des ondes à empêcher le dépôt de cellules et de fournir l'oxygénation. L'hydrodynamique pour ce procédé sont différents de la cuve à agitation et le volume maximal est limité à 1 000 L. Les différences peuvent influer sur la croissance cellulaire et la production de produits. D'autres systèmes à usage unique combinent la cuve agitée avec le réacteur jetable, fournir une plate-forme avec un minimum d'infrastructure et les frais généraux associés, et la capacité de haut débit bioprocédés 4.
Les nouveaux utilisateurs de bioréacteurs de paillasse peuvent avoir du mal à déterminer les consignes initiales de pH, pO 2 et températuretempérature, mais les recherches publiées peut être référencé pour cette information 5, 6, 7, 8, 9. Avec des cultures bactériennes en particulier, il est recommandé de commencer l'agitation à la même vitesse que le flacon à secousses et la température à la même valeur de consigne. pH de la culture à partir de fioles d'agitation par secousses précédentes pistes peut également être utilisé en tant que point de départ. Réglage de la valeur pO 2 est plus difficile et est généralement déterminée de manière empirique. Cependant, à partir de 50% pO 2 est un point de départ recommandée.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été un soutien dans le cadre de l'Université Johns Hopkins, Bureau du prévôt grâce à l'Initiative des sciences de la passerelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
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- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
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- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
