La operación de un biorreactor de sobremesa
Summary
Los fermentadores se utilizan para aumentar el rendimiento de la cultura y la productividad de las células obtenidas por biotecnología. Después de revisar varios microbios o animales candidatos de cultivo de células en matraces de agitación, el siguiente paso lógico es incrementar la biomasa del cultivo seleccionado con el fermentador. Este video muestra la configuración y el funcionamiento de un sistema típico de biorreactor de sobremesa.
Abstract
Sistemas de fermentación se utilizan para proporcionar un entorno de crecimiento óptimo para muchos tipos diferentes de cultivos de células. La capacidad ofrecida por fermentadores para controlar cuidadosamente la temperatura, el pH y las concentraciones de oxígeno disuelto en particular, los hace esencial para el crecimiento a gran escala eficiente y la expresión de productos de fermentación. Este video describe brevemente las ventajas del fermentador en el frasco de agitación. También identificará los componentes clave de un sistema típico de la fermentación de sobremesa y dar instrucción básica sobre la configuración de la embarcación y la calibración de sus sondas. El espectador se familiariza con el proceso de esterilización y se muestra cómo inocular el medio de cultivo en el recipiente con la cultura. También se mostraron los conceptos básicos de manejo, muestreo, y la cosecha. También se debatirá sobre el análisis de datos simple y limpieza del sistema.
Introduction
La tecnología de fermentación básica es una extensión de la técnica de matraz de agitación simple para crecimiento de cultivos. Se desarrolló a partir del deseo de controlar los entornos de crecimiento de cultivos vivos de una manera más completa y cuantitativa. Agitar frascos cultivo discontinuo se limitan generalmente a control impreciso de temperatura. La uniformidad de la temperatura en un agitador incubados o sala caliente es muy variable, a veces se desviaba 5 ° C o más desde el punto de ajuste deseado. Desde el matraz de agitación normalmente se agita a una velocidad fija, el intercambio de la absorción de oxígeno y de gas es limitada. Una vez que el oxígeno ambiental disponible se agota, la mayoría de las culturas no se desarrollan. No hay control del pH en matraces de agitación. En muchos casos, si la cultura no está limitado por prima de alimentación, se convierte en ácido hasta el punto de detrimento de la cultura y la respiración se ralentiza dramáticamente. La mayoría de agitar matraz culturas también se ejecutan como un «lote», lo que significa que se alimentan sólo una vez en o cerca del principio de las culturas inoculation. Después de que se consume esta fuente de carbono inicial, la cultura deja de crecer. En algunos casos, su metabolismo puede cambiar y empezar a consumir otros metabolitos en el caldo de cultivo, a veces cambiando las características de la biomasa resultante o proteína. Frascos de agitación también suelen estar sujetos a la pérdida por evaporación de comunicación en ambientes de cultivo de verano, por lo general el 10% del volumen por 24 horas a 37 ° C. Esta pérdida cambia la densidad del cultivo y se prohíbe el funcionamiento a largo plazo del sistema. Finalmente, el usuario puede encontrar la formación de espuma de los medios de comunicación después de la agitación. La aparición de espuma en el espacio de cabeza por encima de la cultura limitará el intercambio de gases y un mayor crecimiento de la babilla.
El sistema de fermentación básica está diseñado para hacer frente a todas estas limitaciones. El control cuidadoso de la temperatura se consigue en recipientes de fermentación por el uso de la agitación del impulsor y una camisa de calentamiento. Un sensor insertado en el recipiente y la retroalimentación de control de la calefacción y refrigeración de esta chaqueta generalmenteresultados en el control de temperatura de ± 0,1 ° C en torno a la consigna. Fermentadores de sobremesa generalmente proporcionan un control de pH mediante la adición de reactivo líquido a través de una bomba. El valor de pH se controla continuamente en un esfuerzo para mantener el óptimo entorno para el crecimiento celular. La correcta aireación se mantiene por el impulsor de mezcla antes mencionada o por la infusión de aire o gas de oxígeno suplementado directamente en la cultura. Con los cultivos sensibles al cizallamiento, el gas oxígeno complementado es el principal mecanismo para el mantenimiento del nivel de oxígeno en la cultura. La medición de oxígeno en solución se consigue normalmente por una sonda polarográfica que normalmente no está disponible para su uso en matraces de agitación. También es posible añadir de forma continua o periódicamente de alimentación al recipiente para mantener el crecimiento de una forma lineal o exponencial. El condensador de gas de salida proporciona una superficie fría para el vapor en el flujo de gas de escape para condensar, preservando así volumen de cultivo y la densidad. Además periódica de surfactante antiespumante es accionadapor una sonda de conductividad en la cultura, la reducción de la espuma en la superficie y permitiendo el intercambio de gases.
El buque, con todas las sondas, los accesorios, los impulsores, tuberías de recolección, y los tubos, se monta y se esteriliza en una autoclave estándar. Después de calibraciones sonda definitiva y la estabilización de entorno operativo, se añade la cultura de la embarcación. El sistema puede entonces ser utilizado para caracterizar la cultura de una manera que es más cuantitativa y precisa que con un método de frasco de agitación. El control estricto de la temperatura, pH, contenido de oxígeno, consumo de alimento, la evaporación de líquido, y niveles de espuma, todo ello contribuye a una mucho mayor biomasa y mejor rendimiento de proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biorreactores de tanque agitado son el estándar en la industria de la biotecnología y se han utilizado durante más de 40 años 1. El tanque agitado pequeña ha sido importante para la ampliación, a escala reducida, la optimización de la tensión, la caracterización y desarrollo de procesos. También puede tener un papel importante en el desarrollo de la medicina individualizada 2. El biorreactor pequeña escala es más similar a las condiciones in situ para el crecimiento celular, ya que se puede supervisar y optimizado a lo largo de una carrera. Muy a menudo, los experimentos iniciales se realizaron utilizando matraces de agitación, pero las condiciones en el biorreactor pequeña escala difieren significativamente de la de frasco de agitación. En un experimento, se encontró que las condiciones para el crecimiento óptimo de los E. coli y la producción de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) en el matraz de agitación no se traducen en el depósito de agitación (datos no publicados).
Otros métodos de las células que crecen en gran escala incluyen botellas de rodillos, sencillo usí mecedora biorreactores plataforma 3 y biorreactores más grandes de un solo uso con un volumen de trabajo de 50 a 5000 L. Cada método proporciona desafíos para ampliación, pero ha encontrado un lugar en la producción. El uso único de oscilación biorreactor plataforma es similar a la de tanque agitado, y proporciona un entorno regulado. Se diferencia de la de tanque agitado en que la mezcla se produce debido a un movimiento de balanceo generar ondas para evitar la sedimentación de células y proporcionar la oxigenación. La hidrodinámica para este método son diferentes de la de tanque agitado y el volumen máximo está limitado a 1,000 L. Las diferencias pueden afectar el crecimiento celular y la producción de productos. Otros sistemas de un solo uso se combinan el depósito de agitación con el reactor desechable para, proporcionar una plataforma con un mínimo de infraestructura y sobrecarga asociada, y la capacidad de alto rendimiento bioprocesamiento 4.
Los nuevos usuarios de biorreactores de sobremesa pueden tener problemas para determinar los puntos de ajuste iniciales de pH, pO 2 y temtemperatura, sin embargo, la investigación publicada se puede hacer referencia para esta información 5, 6, 7, 8, 9. Con cultivos bacterianos, en particular, se recomienda iniciar la agitación a la misma velocidad que el matraz agitador y la temperatura en el mismo punto de ajuste. Cultura de pH de matraces de agitación anteriores carreras también se puede utilizar como punto de partida. El ajuste del valor de pO2 es más difícil y se determina normalmente empíricamente. Sin embargo, a partir de 50% PO 2 es un punto de partida recomendado.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto se apoyó en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
