Funcionamento de um biorreator de bancada
Summary
Os fermentadores são usadas para aumentar o rendimento da cultura e da produtividade de células de bioengenharia. Após triagem vários microbianos ou animais de cultura de células candidatos em shaker, o próximo passo lógico é aumentar a biomassa da cultura selecionada com o fermentador. Este vídeo demonstra a instalação e operação de um sistema de bancada biorreator típico.
Abstract
Sistemas de fermentação são usados para proporcionar um ambiente de crescimento ideal para muitos tipos diferentes de culturas de células. A capacidade proporcionada pela fermentadores para controlar cuidadosamente a temperatura, o pH e as concentrações de oxigénio dissolvido, em particular, torna essencial para o crescimento em larga escala eficiente e da expressão de produtos de fermentação. Este vídeo vai descrever brevemente as vantagens do fermentador durante o balão de agitação. Ele também irá identificar os principais componentes de um sistema de fermentação típico de bancada e dar instruções básicas sobre a configuração do navio e calibração de suas sondas. O telespectador vai se familiarizar com o processo de esterilização e mostrado como inocular o meio de crescimento no vaso com a cultura. Conceitos básicos de operação, a amostragem, e colheita também será demonstrado. Também será discutida a análise de dados simples e limpeza do sistema.
Introduction
A tecnologia básica de fermentação é uma extensão da técnica frasco agitado simples para o cultivo de culturas. Ele cresceu a partir do desejo de controlar os ambientes de crescimento para culturas vivas de uma forma mais completa e quantitativa. Lote frascos agitados cultura são geralmente limitados pelo controle impreciso da temperatura. Uniformidade de temperatura em um shaker incubadas ou sala quente é altamente variável, às vezes desviando 5 ° C ou mais, do ponto de ajuste pretendido. Uma vez que o balão de agitação é normalmente agitada a uma velocidade fixa, a troca de oxigénio e absorção de gás é limitado. Uma vez que o oxigênio ambiente disponível se esgota, a maioria das culturas não conseguem prosperar. Não há nenhum controlo do pH em frascos de agitação. Em muitos casos, se a cultura não é limitada pela carga de alimentação, torna-se ácida até ao ponto de prejudicar a cultura e respiração diminui drasticamente. A maioria das culturas em balão de agitação também são executados como um "lote", o que significa que eles são alimentados apenas uma vez em ou perto do início das culturas inoculation. Após esta fonte de carbono inicial é consumida, a cultura pára de crescer. Em alguns casos, o seu metabolismo pode deslocar e começar a consumir outros metabolitos no caldo de cultura, por vezes, alterando as características da biomassa resultante ou proteína. Shaker também são geralmente sujeitos a mídia a perda por evaporação em ambientes de cultura mais quentes, geralmente 10% do volume por 24 horas a 37 ° C. Esta perda altera a densidade da cultura e proíbe o funcionamento a longo prazo do sistema. Por fim, o usuário pode encontrar a formação de espuma da mídia após agitação. A ocorrência de espuma no espaço de cabeça acima da cultura vai limitar as trocas gasosas e um maior crescimento do joelho.
O sistema básico de fermentação é projetado para lidar com todas essas limitações. Controle cuidadoso da temperatura é conseguido em recipientes de fermentação pela utilização de agitação do impulsor e uma camisa de aquecimento. Um sensor inserido no navio e feedback de controle de aquecimento e arrefecimento de uma jaqueta normalmenteresulta em controle de temperatura ± 0,1 ° C em torno do valor nominal. Fermentadores de bancada geralmente fornecem o controle de pH através de adição de reagentes líquidos através de uma bomba. O valor de pH é monitorado continuamente, em um esforço para manter o ambiente ideal para o crescimento celular. Arejamento adequado é mantido pelo impulsor de mistura acima mencionada ou pela infusão de ar ou oxigénio gasoso suplementado directamente na cultura. Com culturas sensíveis ao cisalhamento, o gás oxigênio complementada é o principal mecanismo para a manutenção do nível de oxigênio na cultura. A medição do oxigénio em solução é geralmente conseguido por uma sonda polarográfica que não está normalmente disponível para utilização em frascos de agitação. Também é possível adicionar de forma contínua ou periodicamente de alimentação para o recipiente para manter o crescimento de uma forma linear ou exponencial. O gás de saída do condensador fornece uma superfície fria de vapor no fluxo dos gases de escape para condensar, preservando assim o volume da cultura e densidade. Adição periódica de anti-espuma tensioactivo é actuadapor uma sonda de condutividade na cultura, a redução de espuma na superfície e permitindo a troca de gás.
O navio, com todas as sondas, acessórios, impulsores, tubos de colheita, e tubos, é montado e esterilizado num autoclave padrão. Após as calibrações de sonda final de estabilização e ao ambiente de operação, a cultura é adicionada ao recipiente. O sistema pode, então, ser utilizado para caracterizar a cultura de uma forma que é mais quantitativo e preciso do que com um método em frasco de agitação. O controlo rigoroso da temperatura, pH, teor de oxigénio, consumo de alimento, o líquido de evaporação, e níveis de espuma contribuem para uma biomassa muito mais elevada e melhor rendimento de proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biorreatores de tanque agitado são o padrão da indústria de biotecnologia e têm sido utilizados por mais de 40 anos 1. O pequeno tanque agitado tem sido importante para o aumento de escala, escala-down, otimização de tensão, caracterização e desenvolvimento de processos. Também pode ter um papel importante no desenvolvimento da medicina individualizada 2. O biorreator de pequena escala é mais parecida com condições in situ para o crescimento celular, porque ele pode ser monitorado e otimizado ao longo de um prazo. Na maioria das vezes, as experiências iniciais são realizadas usando balões de agitação, mas as condições no biorreactor de pequena escala difere significativamente do balão de agitação. Em um experimento verificou-se que as condições para o crescimento ideal do E. coli e a produção de Proteína Fluorescente Verde (GFP) no frasco de agitação não se traduziu para o tanque agitado (dados não publicados).
Outros métodos de células cultivadas em larga escala incluem garrafas de rolo, único use balançando biorreatores plataforma 3 e maiores biorreatores de uso único com volumes de trabalho de 50 para 5.000 L. Cada método oferece desafios para scale-up, mas encontrou um lugar em produção. O uso único de balanço plataforma bioreactor é semelhante ao tanque agitado, e proporciona um ambiente regulado. Difere do tanque agitado em que a mistura ocorre devido um movimento de balanço para gerar ondas para impedir a sedimentação das células e fornecer oxigenação. A hidrodinâmica para este método são diferentes do tanque agitado e volume máximo é limitado a 1,000 L. As diferenças podem afectar o crescimento celular e produção de produto. Outros sistemas de uso único combinar o tanque agitado com o reator descartável para, fornecer uma plataforma com um mínimo de infra-estrutura e sobrecarga associada, ea capacidade de high-throughput Bioprocessing 4.
Novos usuários de biorreatores de bancada pode ter problemas para determinar valores nominais iniciais para pH, pO 2 e temperaturatura, no entanto, a pesquisa publicada pode ser referenciado por esta informação 5, 6, 7, 8, 9. Com culturas de bactérias, em particular, recomenda-se iniciar a agitação à mesma velocidade que o balão agitador e a temperatura ao mesmo ponto de ajuste. Cultura de pH a partir de frascos de agitação é executado anteriores também podem ser utilizadas como um ponto de partida. Ajuste do valor pO 2 é mais difícil e normalmente é determinado empiricamente. No entanto, começando com 50% pO 2 é um ponto de partida recomendado.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi o apoio em parte pela Johns Hopkins University, Gabinete do Reitor através da Iniciativa Ciência Gateway.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
