Il funzionamento di un bioreattore da banco
Summary
Fermentatori sono utilizzati per aumentare la cultura resa e produttività delle cellule bioingegneria. Dopo la proiezione più microbiche o animali candidati colture di cellule in fiasche di scuotimento, il prossimo passo logico è quello di aumentare la biomassa della coltura selezionata con il fermentatore. Questo video dimostra l'installazione e il funzionamento di un tipico sistema di bioreattore da banco.
Abstract
Sistemi di fermentazione sono utilizzati per fornire un ambiente di crescita ottimale per diversi tipi di colture cellulari. La possibilità offerta dalla fermentatori per controllare accuratamente la temperatura, il pH e la concentrazione di ossigeno disciolto in particolare rende indispensabile efficiente crescita su grande scala e l'espressione di prodotti di fermentazione. Questo video descrivere brevemente i vantaggi del fermentatore sul in pallone. Sarà inoltre identificare i componenti fondamentali di un tipico sistema di fermentazione da banco e dare istruzioni di base sulla configurazione della nave e la taratura delle sue sonde. Lo spettatore sarà familiarizzato con il processo di sterilizzazione e mostrato come inoculare il terreno di coltura in vaso con la cultura. Saranno inoltre dimostrato concetti di base di funzionamento, il campionamento e raccolta. Saranno inoltre discussi l'analisi dei dati semplice e la pulizia del sistema.
Introduction
Tecnologia di base fermentazione è un'estensione della tecnica semplice in pallone per la coltivazione di colture. Essa nasce dalla volontà di controllare gli ambienti di crescita per le colture vive in modo più completo e quantitativa. Batch fiaschi cultura scuotimento sono in genere limitati dal controllo impreciso della temperatura. Uniformità di temperatura in un agitatore incubate o camera calda è molto variabile, a volte allontanandosi 5 ° C o più dal valore di riferimento previsto. Poiché l'in pallone viene normalmente agitata ad una velocità fissa, scambio consumo di ossigeno e gas è limitata. Una volta che l'ossigeno ambiente disponibile è esaurito, la maggior parte delle culture non riescono a prosperare. Non vi è alcun controllo del pH in flaconi di scuotimento. In molti casi, se la cultura non è limitata dalla scorta di alimentazione, diventa acida al punto di danno alla cultura e la respirazione rallenta drasticamente. La maggior parte delle culture del dibattimento in pallone vengono eseguiti anche come un 'lotto', il che significa che sono alimentati solo una volta o vicino all'inizio delle culture inoculation. Dopo questa fonte di carbonio iniziale è consumato, la cultura smette di crescere. In alcuni casi il suo metabolismo può spostarsi e cominciare a consumare altri metaboliti nel brodo di coltura, a volte cambiando le caratteristiche della biomassa risultante o proteine. Fiaschi di scuotimento sono di solito soggetti a perdite per evaporazione media in ambienti di coltura più caldi, in genere il 10% del volume per 24 ore a 37 ° C. Questa perdita, la densità della cultura e proibisce il funzionamento a lungo termine del sistema. Infine, l'utente può verificare la formazione di schiuma dal supporto dopo agitazione. La presenza di schiuma nello spazio di testa al di sopra della cultura limiterà lo scambio di gas e di ulteriore crescita ginocchio.
Il sistema di fermentazione di base è progettato per soddisfare tutte queste limitazioni. Controllo della temperatura attenta è raggiunto in vasi di fermentazione con l'uso di girante agitazione e una camicia di riscaldamento. Un sensore inserito nel recipiente e retroazione di controllo di riscaldamento e raffreddamento di questa giacca solitorisultati nel controllo della temperatura ± 0.1 ° C intorno al setpoint. Fermentatori da banco in genere forniscono il controllo del pH tramite aggiunta del reagente liquido attraverso una pompa. Il valore del pH è costantemente monitorato nel tentativo di mantenere la ottimale per la crescita delle cellule. Aerazione corretta è mantenuta dalla girante miscelazione o la suddetta dall'infusione di aria o gas ossigeno integrato direttamente nella cultura. Con colture sensibili al taglio, gas ossigeno integrato è il meccanismo principale per il mantenimento del livello di ossigeno nella cultura. Misura di ossigeno in soluzione si ottiene di solito da una sonda polarografica che non è normalmente disponibile per l'uso in flaconi di scuotimento. È anche possibile aggiungere continuamente o periodicamente mangime al recipiente per mantenere la crescita in modo lineare o esponenziale. Il condensatore di gas in uscita fornisce una superficie fredda per il vapore nel flusso di gas di scarico di condensare, preservando in tal modo il volume cultura e densità. Aggiunta periodica di antischiuma tensioattivo è azionatoda una sonda di conducibilità nella cultura, riducendo schiuma sulla superficie e consentendo lo scambio di gas.
La nave, con tutte le sonde, raccordi, giranti, tubi di raccolta, e tubi, viene assemblato e sterilizzato in autoclave standard. Dopo calibrazioni di sonde finale e stabilizzazione di ambiente operativo, la coltura è aggiunto al recipiente. Il sistema può quindi essere utilizzato per caratterizzare la cultura in un modo che è più quantitativa e precisa che con un metodo in pallone. Stretto controllo della temperatura, pH, contenuto di ossigeno, consumo di mangime, liquido evaporazione, e livelli di schiuma contribuiscono a una biomassa molto elevata e quindi un rendimento proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioreattori serbatoi agitati sono gli standard nel settore Biotecnologie e sono stati utilizzati per oltre 40 anni 1. Il piccolo serbatoio di agitazione è stato importante per scale-up, scale-down, ottimizzazione ceppo, caratterizzazione e sviluppo di processo. Esso può anche avere un ruolo importante nello sviluppo della medicina individualizzata 2. Il bioreattore piccola scala è più simile a condizioni in situ per la crescita cellulare, perché può essere monitorato e ottimizzato tutta una corsa. Molto spesso, i primi esperimenti sono eseguiti utilizzando palloni di scuotimento ma le condizioni del bioreattore piccola scala differiscono significativamente dal dibattimento in pallone. In un esperimento abbiamo scoperto che le condizioni per la crescita ottimale di E. coli e produzione di proteina fluorescente verde (GFP) nel pallone shake non si traducono al serbatoio agitato (dati non pubblicati).
Altri metodi di cellule in coltura su larga scala includono bottiglie di rulli, unico use a dondolo bioreattori piattaforma 3 e grandi bioreattori monouso con volumi di lavoro da 50 a 5.000 L. Ogni metodo prevede sfide per scale-up, ma ha trovato un posto in produzione. L'uso singolo dondolo piattaforma bioreattore è simile al serbatoio agitato, e fornisce un ambiente regolato. Si differenzia dal serbatoio agitato dal fatto che la miscelazione avviene a causa di un movimento oscillante per generare onde per prevenire sedimentazione delle cellule e fornire ossigenazione. L'idrodinamica per questo metodo sono diversi dal serbatoio agitato e volume massimo è limitato a 1.000 L. Le differenze possono influenzare la crescita cellulare e la produzione del prodotto. Altri sistemi monouso uniscono il serbatoio agitato con il reattore usa e getta per, fornire una piattaforma con un minimo di infrastrutture e overhead associato, e la capacità di high-throughput Bioprocessing 4.
I nuovi utenti di bioreattori da banco possono avere difficoltà a determinare valori di riferimento iniziali per pH, pO 2 e temtemperatura, tuttavia, la ricerca pubblicata possibile fare riferimento per queste informazioni 5, 6, 7, 8, 9. Con colture batteriche in particolare, si raccomanda di iniziare agitazione alla stessa velocità del matraccio agitatore e la temperatura alla stessa setpoint. Cultura pH da precedenti boccette shake piste può essere utilizzato anche come punto di partenza. Impostazione del valore di pO 2 è più difficile ed è tipicamente determinata empiricamente. Tuttavia, a partire 50% pO 2 è un punto di partenza raccomandata.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato il supporto in parte dalla Johns Hopkins University, Ufficio del prevosto attraverso il Science Initiative Gateway.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
References
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
