Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em> In vivo</em
Summary
Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar<em> In vivo</em> Bağlam. Doğru vasküler pleksus görselleştirmek için immunofluorescent boyama çalışmaları bu tür başarısı için çok önemlidir.
Abstract
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının filizlenmesi tarafından tanımlanan yeni kan damarı oluşumunu ve karmaşık bir süreçtir. Anjiyogenez, kanser, körlük ve iskemik hastalıklar gibi kan damarı oluşumunu düzensiz olduğu birçok hastalık, aynı zamanda, sadece organ ve dokuların normal gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır, ancak. Anjiyogenez hastalığında özellikle yeni damar oluşumunu denemek ve düzenlemek için yeni ilaç gelişimi için önemli bir hedef bu yüzden yetişkin yaşamda, kan damarları genellikle sakin olan. Daha iyi anjiyogenez anlamak ve düzenlemek için uygun stratejiler geliştirmek amacıyla, modeller doğru dahil olan farklı biyolojik adımları yansıtan gereklidir. Damar sertliği, damar ve kılcal doğumdan sonraki ilk hafta içinde vasküler pleksus oluşturmak için geliştirmek için fare yenidoğan retina damar mükemmel bir model sunar. Bu model aynı zamanda, iki-di sahip olma avantajına sahiptirmensional (2B) yapısı diğer damar ağları karmaşık 3D anatomisi ile karşılaştırıldığında basit analizi yapma. Doğum sonrası farklı zamanlarda retinal vasküler pleksus analiz ederek, bu mikroskop altında anjiogenez çeşitli aşamalarında gözlemlemek mümkündür. Bu makalede, isolectin ve vasküler spesifik antikorlar ile floresan boyama kullanılarak bir fare retina damar analiz etmek için basit bir işlem ortaya koymaktadır.
Introduction
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının oluşumu ile tanımlanan ve çok sayıda sinyal yolları ile düzenlenmiş olan karmaşık bir gelişimsel bir süreçtir. Bunların en önemli VEGF yoldur. VEGF komşu kan damarlarında çimlenme anjiyogenik en başlamadan iskemik hücreleri ve yol tarafından serbest bırakılır. Filiz yeni bir damar önde gelen endotel hücre VEGF kaynağına doğru ulaşmak olduğunu filopodia üreten bir 'ipucu' hücre, ve 'sap' endotel hücreleri prolifere takip eder. Bu şekilde, aktive edilmiş endotel hücreleri göç eder ve bunlar, yeni damar tüpler oluşturmak burada avasküler bir bölge doğru çoğalır. Kan akışını desteklemek için bu tüpler stabilize etmek amacıyla, endotelial hücreler perisitler ve yeni kan damarlarının 1 çevreleyen yumuşak kas hücreleri ile etkileşime girer. Anjiyogenez, embriyo ve artan doku vaskülarizasyonu için gereklidir. Bununla birlikte, aynı zamanda pek çok patolojik katkıdakanser gibi kalori bozuklukları; anjiyogenez bozukluklar iskemik hastalıkları ile ilişkili ise. Hastalığın tedavisi için bir araç olarak anjiyojenez düzenleyen etkili ilaç tedavilerinin geliştirilmesi büyük ilgi taşımaktadır. Örneğin, etkili bir anti-anjiyojenik faktörler, kanser büyümesini azaltmak pro-anjiyogenik stratejiler iskemik bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir iken olacaktır. Böylece, anjiyogenez modelleri daha iyi yeni damar oluşumu ve vasküler büyüme artırmak veya azaltmak için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için düzenleme anlamak için gereklidir.
Anjiyogenez araştırma temel bir unsuru uygun bir damar modelinin seçimdir. In vitro modellerde pek çok tür endotel hücre göçü, çoğalması ve hayatta kalma 2,3 olarak anjiyogenez temel adımları yeniden tasarlanmıştır. Sıklıkla in vitro tahlilinde kullanılan bir rağmen t bir Matrigel matrisi üzerinde endotelyal hücre, bir dallı bir şebeke oluşumuonun endotel hücreleri için spesifik değildir, ne de genellikle perisit ve düz kas hücrelerinin destek dahil etmez. Bu tür vücut embriyoit tahlilinde, aortik halka deneyi ve fetal metatarsal deneyi gibi fare organ kültürü ile ex vivo olarak filizlenme anjiyogenez Değerlendirilmesi ek destek hücreleri bağlamında endotel hücrelerinin damar analizine izin verir. Bununla birlikte, bu testler, ana sınırlamaları analiz için sınırlı bir pencere vererek, kan akışının olmaması ve zaman içinde damarlarının regresyon içerir. Bu nedenle, daha doğru bir anjiyogenez düzenleme anlamak için, in vivo modellerde de arka kol veya bacak iskemisi model olarak, örneğin deri altına implante edilen sünger veya fişleri Matrigel kullanılarak fare geliştirilenlerdir olarak gereklidir. Ancak, bu modeller neovessels karmaşık 3D mimarisi nedeniyle analiz etmek zordur. Buna karşılık, zebrabalıkları embriyo tamamının görüntülenmesi anjiyogenez için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştırorganizma 4. Bununla birlikte, fare, fare birçok durumda, tercih edilen bir model yapımı evrimsel olarak çok daha yakından zebrabalıkları göre insan ile ilgilidir. Sonuç olarak doğum sonrası fare retinanın anjiyogenez anjiyogenez araştırmalar için tercih edilen bir iyi karakterize yöntem temsil eder. Bu fizyolojik bir ayar, aynı zamanda kolayca uygun floresan lekeleri kullanılarak görüntülendi edilebilir bir 2D vasküler pleksus sağlar sadece. Damar ağı, endotel proliferasyonu, çimlenme, perivasküler hücre toplanması ve gemi yeniden bir mimarisi tüm bu teknik kullanılarak incelenebilir.
Neonatal fare retinasında, retinal kan damarlarının gelişimi Postnatal ilk haftasında meydana gelir. Fareler, insanlar farklı, kör doğarlar ve retina sadece doğumdan sonra vaskülarize olur. Retina damarları doğum sonrası gün 0 (P0) de optik sinir retina yakın merkezinde kaynaklanan ve son derece düzenlemek oluşturmak için anjiyogenez tarafından geliştirmekyaklaşık P8 5 ile retina çevre ulaşır d vasküler pleksus. Kan damarları kılcal pleksus yavaş yavaş bir araya kapiller ağı ile arterler ve venler düzenli bir alternatif desen oluşturmak için çevre doğru optik disk dışarı doğru büyüyen karakteristik bir şekilde gelişir. Retina damar böylece nispeten kolay düz montaj hazırlıkları 5 retina damar incelemek için yapım, onlar aslında bir 2D düzlemde ne de büyüdükçe damarlar kolayca tespit edilebilir olarak anjiyogenez çalışmak için ideal bir model sağlar. Birkaç saat ex vivo olarak endotelial fazla uç hücre yanıtlarının analizi için Yeni doğan fare retina izole edilmesi için bir yöntem olup 6 bildirilmiştir. Alternatif olarak, tüm retina damar ve ilişkili vasküler işaretleri daha ayrıntılı bir araştırma farklı gelişim aşamalarında sabit retina örneklerinin immün gerektirir.
Burada sağlamakBiz mikroskop altında son görüntüleme için boyama protokolleri ile (ayrıca 7) doğum sonrası gözün ilk enükleasyon gelen fare retina vasküler pleksus, ve tüm montaj boyama için kullandığınız güvenilir ve teknik yalındır yöntemi ayrıntılı bir açıklama.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem anjiogenezin kolay ölçülebilir ve fizyolojik ilgili model yapımı, yenidoğan fare retina lekeli bütün montaj hazırlıkları görüntüler elde etmek için basit ve etkili bir yol sunar. Başlangıçta, fare göz küçük boyutu ve dünya şekli nedeniyle incelemek için oldukça zor olabilir, biraz pratik ve iyi diseksiyon araçları güvenilir sonuçlar için gereklidir bu yüzden. Bu göz su kaybı küçük bir miktar neden olur ve diseksiyon kolaylaştırır içi yörünge basıncı aza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wellcome Trust ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
