Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em> In vivo</em

L'angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una 'punta' cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali 'gambo'. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni ^1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell'embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l'angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare.

Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell'angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza ^2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l'analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell'angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell'arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l'embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo ^4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L'architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica.

Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa ⁵ P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l'esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l'angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio ^5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato ^6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo.

Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell'occhio postnatale (vedere anche ⁷⁾ attraverso i protocolli di colorazione per l'imaging finale al microscopio.