Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em> En vivo</em

La angiogénesis es un proceso de desarrollo complejo definido por la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes y está regulada por varias vías de señalización. La más destacada de éstas es la vía del VEGF. VEGF es liberada por las células isquémicas y conduce a la iniciación de brotes angiogénicos en los vasos sanguíneos vecinos. La célula endotelial líder de un nuevo brote vascular es una célula de 'punta', que produce filopodios que alcanzan hacia fuera hacia la fuente de VEGF, y es seguida por la proliferación de células endoteliales 'tallo'. De esta manera, las células endoteliales activadas migran y proliferan hacia una región avascular, donde forman nuevos tubos vasculares. Con el fin de estabilizar estos tubos para apoyar el flujo de sangre, las células endoteliales interactúan con los pericitos y células musculares lisas, que rodean los vasos sanguíneos nuevos ^1. La angiogénesis es esencial para la vascularización del embrión y tejidos en crecimiento. Sin embargo, también contribuye a muchos patológicatrastornos de cal como el cáncer; mientras que defectos en la angiogénesis están asociados con enfermedades isquémicas. Por consiguiente, el desarrollo de tratamientos farmacológicos eficaces para regular la angiogénesis como un medio de tratamiento de la enfermedad es de gran interés. Por ejemplo, los factores anti-angiogénicos eficaces reducirán el crecimiento del cáncer, mientras que las estrategias de pro-angiogénicos pueden ser usados ​​para tratar la enfermedad isquémica. Por lo tanto, los modelos de angiogénesis son esenciales para entender mejor la regulación de la formación de nuevos vasos y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar o disminuir el crecimiento vascular.

Un elemento fundamental de la investigación de la angiogénesis es la elección de un modelo vascular apropiada. Muchos en modelos in vitro se han diseñado para reproducir los pasos básicos de la angiogénesis tales como la migración de células endoteliales, proliferación y supervivencia ^2,3. A utilizado con frecuencia en el ensayo in vitro es la formación de una red ramificada de células endoteliales sobre una matriz de Matrigel, aunque tla suya no es específico de las células endoteliales, ni tampoco suelen incorporar el apoyo de los pericitos o células del músculo liso. Evaluación ex vivo de la angiogénesis brotación usando cultivo de órganos de ratón, tales como el ensayo de cuerpo embrioide, el ensayo de anillo aórtico y el ensayo metatarsiano fetal permite el análisis de la angiogénesis de las células endoteliales en el contexto de células de soporte adicionales. Sin embargo, las principales limitaciones de estos ensayos incluyen la falta de flujo de sangre y la regresión de los vasos a través del tiempo, dando una ventana limitada para el análisis. Por lo tanto, para comprender la regulación de la angiogénesis con mayor precisión, en modelos in vivo son necesarios tales como los desarrollados en el ratón utilizando esponjas implantadas por vía subcutánea o tapones de matrigel, así como el modelo de isquemia de las extremidades posteriores. Sin embargo, estos modelos son difíciles de analizar debido a la compleja arquitectura 3D de los neovasos. En contraste, el embrión de pez cebra ha demostrado ser un excelente modelo para la visualización de la angiogénesis en el conjuntoorganismo ^4. Sin embargo, el ratón es evolutivamente mucho más estrechamente relacionada con la humana que pez cebra, haciendo que el ratón un modelo preferido en muchos casos. Por consiguiente la angiogénesis de la retina del ratón postnatal representa un método bien caracterizado de elección para la investigación angiogénesis. No sólo proporciona un entorno fisiológico, pero también un plexo vascular 2D que puede ser fácilmente visualizado utilizando manchas fluorescentes apropiados. La arquitectura de la red de vasos, la proliferación endotelial, germinación, reclutamiento de células perivasculares y remodelado vascular todo puede ser investigada utilizando esta técnica.

En la retina del ratón neonatal, el desarrollo de los vasos sanguíneos de la retina se produce en la primera semana de vida postnatal. Los ratones, a diferencia de los humanos, nacen ciegos y las retinas sólo son vascularizados después del nacimiento. Surgen vasos de la retina desde el centro de la retina cerca del nervio óptico en el día postnatal 0 (P0), y se desarrollan por la angiogénesis para formar un altamente organizard plexo vascular que llega a la periferia de la retina en aproximadamente ⁵ P8. Los vasos sanguíneos se desarrollan de una manera característica con el plexo capilar creciente gradualmente hacia fuera desde el disco óptico hacia la periferia para generar un modelo de alternancia regular de las arterias y venas con una red capilar intervenir. La vasculatura de la retina proporciona un modelo ideal para estudiar la angiogénesis como los vasos se pueden identificar fácilmente a medida que crecen en lo que es esencialmente un plano 2D, por lo que es relativamente fácil de examinar la vasculatura de la retina en los preparativos de montaje plana ^5. Un método para el aislamiento de la retina del ratón neonatal para el análisis de las respuestas de células endoteliales punta durante varias horas ex vivo ha sido reportado ^6. Alternativamente, una investigación más detallada de toda la vasculatura de la retina y de los marcadores vasculares asociadas requiere la inmunotinción de muestras de retina fijos en diferentes etapas de desarrollo.

Aquí proporcionamosuna descripción detallada de un método fiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción de todo el montaje de la retina plexo vascular murino, de la enucleación del ojo inicial postnatal (ver también ⁷⁾ a través de los protocolos de tinción a la imagen final bajo el microscopio.