新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供<em生体内で></em>コンテキスト。正確に血管叢を可視化する免疫蛍光染色は、研究のこれらのタイプの成功に極めて重要です。
血管新生は、既存の血管ネットワークから新規血管の発芽によって定義された新しい血管形成の複雑なプロセスである。血管新生は、臓器や組織の正常な発達ではなく、例えば、癌、失明や虚血性疾患などの血管形成を調節不全である、多くの疾患、だけでなく、重要な役割を果たしている。大人の生活の中で、血管が新生が病気に特異的に新しい血管の形成を試み、規制する新たな薬剤開発のための重要なターゲットであるので、一般的に静止しています。優れた血管新生を理解し、それを規制するための適切な戦略を開発するために、モデルが正確に関与する異なる生物学的工程を反映していることが必要である。動脈、静脈と毛細血管が出産後の最初の週の間に血管叢を形成するために開発するため、マウス新生児の網膜は、血管新生の優れたモデルを提供します。このモデルは、2つの – ジを有するという利点を有するmensional(2D)構造は、他の血管のネットワークの複雑な3D解剖と比較して簡単な解析を行う。出生後の異なる時点で網膜血管叢を解析することにより、顕微鏡下で血管新生の様々な段階を観察することが可能である。この記事ではイソレクチンと血管特異的な抗体で蛍光染色を用いたマウス網膜の血管構造を解析するための簡単な手順を示しています。
血管新生は、既存の血管ネットワークから新たな血管の形成によって定義され、いくつかのシグナル伝達経路により調節される複雑な発達過程である。これらの最も顕著なのはVEGF経路である。 VEGFは、隣接血管の発芽血管新生の開始に虚血細胞及びリードによって解除される。芽新しい血管からの主要な内皮細胞は、VEGFの源に向かって手を差し伸べることを糸状仮足を作り出す '先端'セル、であり、 '茎'内皮細胞増殖が続いている。このように、活性化内皮細胞は移動し、それらが新しい血管の管を形成する無血管領域に向かって増殖する。血流をサポートするために、これらのチューブを安定化させるために、内皮細胞は、周皮細胞と新しい血管1を囲む平滑筋細胞と相互作用する。血管新生は胚と成長組織の血管新生のために不可欠です。しかし、それはまた、多くのpathologiに寄与する癌などのCAL障害;血管新生における欠陥は虚血性疾患に関連付けられているのに対し、。疾患を治療するための手段として血管形成を調節するための効果的な薬物治療の開発は非常に興味深いことである。例えば、効果的な抗血管新生因子は、血管新生促進戦略は虚血性疾患の治療に使用することができる一方で、癌の増殖を減少させる。したがって、血管新生のモデルは、より良い新たな血管の形成と血管の成長を高めるか、または減少させるための新たな治療戦略を開発するための規則を理解することが不可欠です。
血管新生研究の基本的な要素は、適切な血管モデルの選択です。 in vitroモデルの多くは、このような内皮細胞の遊走、増殖および生存2,3のような血管形成の基本的な手順を再現するように設計されている。トンが頻繁にin vitroアッセイで使用される、マトリゲルマトリックス上内皮細胞の分枝ネットワークの形成である彼は、内皮細胞に特異的なものではなく、また、通常は周細胞又は平滑筋細胞の支持体を組み込んでいない。このような胚様体アッセイ、大動脈リングアッセイおよび胎児の中足骨アッセイとして、マウスの器官培養を用いたex vivoで発芽血管新生の評価は追加の支持細胞の文脈における内皮細胞の血管新生の分析を行うことができます。しかし、これらのアッセイの主な制限は、分析のために限られたウィンドウを与え、血流の欠如、時間の経過とともに血管の退縮が挙げられる。したがって、in vivoモデルにおいて 、より正確に血管新生の調節を理解するために、例えば皮下に移植スポンジ又はマトリゲルプラグ、並びに後肢虚血モデルを用いて、マウスにおいて開発されたものとして必要とされている。しかし、これらのモデルは、新生血管の複雑な3Dアーキテクチャにより分析することが挑戦しています。これとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚全体で血管新生を可視化するための優れたモデルを証明している生物4。しかし、マウスはマウス、多くの場合において好ましいモデル作り、進化的にはるかに密接にゼブラフィッシュより人間に関連しています。結果的に出生後のマウス網膜の血管新生、血管新生研究のための選択のよく特徴付けメソッドを表します。それは生理的な設定だけでなく、容易に適切な蛍光汚れを用いて可視化することができ、2D血管叢を提供するだけでなく。血管ネットワークのアーキテクチャ、内皮増殖、発芽、血管周囲の細胞動員と血管リモデリングは、すべて、この手法を用いて検討することができます。
新生仔マウスの網膜において、網膜血管の発達は出生後の最初の週に起こる。マウスは、人間とは違って、生まれつき目が見えないされ、網膜のみ生後血管なる。網膜血管に近い生後0日(P0)で視神経に網膜の中心部から発生し、高度に組織化を形成するために、血管新生によって開発約P8 5によって網膜周辺部に到達したdの血管叢。血管が徐々に介入して毛細血管網で動脈と静脈の定期的な交流のパターンを生成するために周辺に向かって視神経乳頭から外側に成長毛細血管叢との特性の方法で開発しています。網膜血管系は、このように、それが比較的容易にフラットマウント標本5における網膜血管構造を検討すること、彼らは基本的に2D平面であるものに育つように血管が簡単に識別できるような血管新生を研究するための理想的なモデルを提供します。数時間のex vivoで上内皮先端細胞応答の分析のための新生児マウスの網膜を単離するための方法は、06報告されている。代替的に、全体の網膜血管系および関連血管マーカーのより詳細な調査は、開発の異なる段階で固定網膜標本の免疫染色が必要である。
ここでは、提供する我々は、顕微鏡下で染色プロトコルを介した出生後の眼の初期摘出(また、7参照)から最終的な画像に、マウスの網膜血管叢の全体マウント染色に使用する信頼性と技術的にまっすぐ進む方法の詳細な説明。
ここで紹介する方法は、血管新生の容易に定量化し、生理学的に適切なモデル作り、新生児マウスの網膜のステンドホールマウント標本の画像を取得するための簡単かつ効率的な方法を提供しています。最初は、マウスの目は、その小さなサイズと地球の形状により解剖するのは非常に困難になる可能性がありますので、いくつかの練習と良い解剖ツールは信頼性のある結果を得るため?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ウェルカムトラストと英国心臓財団によって資金を供給された。
Material | |||
Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
Reagents | |||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
BSA | Sigma | A7638 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey serum | Sigma | D9663 | |
Goat serum | Vector | S-1000 | |
Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
Primary Antibodies | |||
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
Secondary Antibodies | |||
Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Microscopes | |||
Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
Confocal Microscope | Nikon | A1R |