Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em> In vivo</em

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula "ponta", que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais "stalk". Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos ^1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular.

Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência ^2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto⁴ organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica.

Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de ⁵ P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem ^5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado ^6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento.

Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a ⁷⁾ por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.