Duyusal nöronlar izolasyonu<em> Aplysia californica</em> Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için
Summary
Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif<em> Aplysia</em> Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.
Abstract
Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.
Introduction
Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin .
Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar> 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır.
Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir.
Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia'nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
