Summary

Duyusal nöronlar izolasyonu<em> Aplysia californica</em> Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif<em> Aplysia</em> Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Abstract

Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.

Introduction

Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin .

Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar> 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır.

Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir.

Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia'nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.

Protocol

1. Hücre Hazırlanması Gün 1, tartmak ve hayvan uyutmak. Bir 30 g kg-1 hayvan tartılır. Izotonik MgCl: 1:1 Uygulama deniz suyu 5-10 hayvan hacimlerde anestezisi. Bu ekli airstone ile elektrikli akvaryum hava pompası gibi havalandırma ile 1 saat 6H 2 0. Diseksiyon malzemeleri hazırlayın. Bu kumaş işaretçilerine olarak paslanmaz çelik düz iğne, temiz diseksiyon tepsi birleştirin. + Penisilin / streptomisin (P / S).; Birkaç Petri yapay deniz suyu …

Representative Results

Bu protokolde hedeflenen gangliyon içindeki duyu nöronlarının yerle BSC ile PVC nöronlar Şekil 1 'de gösterilmiştir. BSC nöronlar bukkal gangliyonu, sağlam ganglion (Şekil 1A) 'de bukkal kütle uzağa dönük yüzeyinin ventral tarafta simetrik 2 oval kümeler halinde bulunmaktadır. PVC nöronlar merkez ekseni (Şekil 1B) doğru plevral ganglion dorsal yüzeyi etrafında saran ikili, V şeklinde kümeler oluştururlar. Sağ veya sol küme olaylar yak…

Discussion

Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar      
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)      
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild    
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer      
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.    
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices    
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions   Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA    
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH    
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek    
Faraday cage     custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs   presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA    
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – WPI 1B150-3  
3 inch length      
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various    
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store   For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP   For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 Becton-Dickinson   For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA   For perfusion system
one-way valves     For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP   For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)      
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100   fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store    
dish holder for microscope stage with isolated ground bath     Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator      

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

References

  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
  3. Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
  4. Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
  5. Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
  6. Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
  7. Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
  8. Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
  9. Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
  10. Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
  11. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  12. Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
  13. Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
  14. R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  15. Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
  16. Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
  17. Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
  18. Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
  19. Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
  20. Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
  21. White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
  22. Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
  23. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).

Play Video

Cite This Article
Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

View Video