Summary

の感覚ニューロンの分離<em>アメフラシカリフォルニ</em>グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

我々は、海洋アメフラシの神経系の解剖を説明<em>アメフラシ</em>麻酔の後、短期·組織培養のための神経細胞、およびパッチクランプ法を介した単一細胞イオン電流の録音の分離。

Abstract

海洋腹足類軟体動物アメフラシカリフォルニは、学習と記憶の研究において特に重要で、神経系機能のモデルとして由緒ある歴史を持っています。このような研究のための一般的な準備は、感覚と運動ニューロンを最小限解剖動物、または個々の感覚と運動ニューロンの技術的に精巧な神経細胞の共培養にそのまま残されているものです。あまり一般的では公称均質ニューロンの小さなクラスターは短期培養における単一細胞に解離されている孤立したニューロンの準備です。そのような単離された細胞は、パッチクランプ技術、およびこれらのコンダクタンスの目標変調を用いたイオン電流の生物物理学的特徴付けに有用である。このような培養物を調製するためのプロトコルが記載されている。プロトコルは胸膜と頬神経の容易に識別グルタミン酸感覚ニューロンを活用して、それらの解離と最小限のメンテナンスを説明I血清を含まない数日間のn文化。

Introduction

海洋opistobranch軟体動物、 アメフラシは 、何十年もの間、有用な神経生物学的モデルとなっています。これは最高の馴化と古典的条件7,8のモデルとして知られています。このモデルでは学習と記憶に関する研究は、彼がArvidカールソンとポールグリーンガード10と共有賞で、エリックR.カンデル2000年に生理学·医学ノーベル賞を受賞した。この無脊椎動物の神経系の要素が付加左神経と筋肉との動物から解剖されている削減の準備からの電気録音を、関与する研究は、 アメフラシの個々の神経細胞の役割を解明に役立っています。しかしアメフラシでの学習を構成する精密な分子メカニズムの識別は、多くの場合、個々のドナー動物から1つずつ取得し別の技術、感覚ニューロンと運動ニューロンの長期共培養を採用し、培養皿21でシナプスを形成させ。

我々は、他の1,3,6、14、15、16は、名目上均質なニューロンのクラスタの解離短期間培養物を作るためにニューロンは、このモデルで対象とすることができる同定ならびに長期の実験では、その耐久性の容易さを利用しているている私たちは、パッチクランプ構成で電圧クランプの下にイオン電流を勉強。多くのアメフラシニューロンは長続き実験操作のための時間を可能にするためにパッチクランプを繰り返しラウンドに立ち上がる。技術は、腹部の神経節の神経分泌袋細胞、解離我々はここで説明する胸膜と頬神経節の感覚ニューロンとしてニューロンのためではなく、非常に大規模なニューロン>60μmの径などのL7またはR2などに便利です腹部神経節。我々は他の場所に記載感覚ニューロン共培養とは異なり、私たちの文化でアメフラシ血清を使用しない。この手順を使用して得られたほとんどのニューロンはtに対してプロセスがなくてもなります彼は全体のセル電圧記録を促進する文化の中で最初の48時間、しかし、その後、新芽や栄養素、および/または成長因子の不足から、死ぬ前におよそ14日間軸索と他のプロセスを詳しく説明します。

この手法は、頬や胸膜神経の生理的に文書化された地域から皿当たり50〜100のニューロンの初代培養を生成します。このプロトコルは、多数の実験は、動物ごとに複製が必要な実験で単一細胞生理学の側面を研究する研究者にとって有用です。それは一致した治療群と対照培養物から研究その利益を可能にして、左右hemigangliaに標的細胞の解剖学的分離に起因する文化のペアを生成します。

プロトコルは、頬神経の頬Sクラスター(BSC)ニューロン、および胸膜神経節の胸膜ventrocaudal(PVC)のニューロンを対象としています。これらの細胞は、全体セル電圧の記録および表示ローバスに適したサイズであるTグルタミン酸応答。議論の方法論は、 アメフラシ神経系の中で最も神経に適しています。

Protocol

1。細胞調製 1日目に、動物の重さと麻酔。 30グラム、1キロの動物を計量。等張のMgCl 1:1海水の5-10動物ボリュームで麻酔。このような添付airstone付き電動アクアリウムエアーポンプとしてエアレーションと1時間6H 2 0。 解剖の供給を準備します。 このような生地のピンとしてステンレス鋼ストレートピン、クリーンな解剖トレイを組み立てます。 +ペ?…

Representative Results

このプロトコルにおいて対象となる神経節内の感覚ニューロンの位置は、BSC及びPVCニューロンは、 図1に示されている。 BSCのニューロンは頬神経節の腹側に2対称の楕円形のクラスター、そのまま神経節( 図1A)で頬塊から離れて対向する面に配置されています。 PVCニューロンは中心軸( 図1B)に向かって胸膜神経節の背面の周りをラップする二国間の?…

Discussion

解離技術はグリアや他の未確認の細胞の小さな数字が点在50〜100孤立したニューロンを含む感覚ニューロンの文化を生み出す、ここで説明。プロトコルの中で最も重要なステップは、神経、酵素溶液中に残存する時間であり、そして、個々の細胞にクラスターを分解する消化細胞塊の解離をフリック。酵素消化(ステップ1.8)が使用可能温度で最適化する必要があります。 23°遅い振とうしな…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P40 OD010952、Korein財団、SLCとATKのメイタグフェローシップへマイアミフェローシップ大学によって資金を供給。作者は感謝アメフラシのための国家資源のスタッフを認めるだけでなく、図のための顕微鏡写真を提供したローレンSimonitisとハンナペック、。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar      
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)      
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild    
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer      
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.    
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices    
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions   Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA    
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH    
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek    
Faraday cage     custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs   presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA    
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – WPI 1B150-3  
3 inch length      
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various    
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store   For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP   For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 Becton-Dickinson   For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA   For perfusion system
one-way valves     For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP   For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)      
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100   fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store    
dish holder for microscope stage with isolated ground bath     Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator      

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

References

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Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

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