בידוד של נוירונים חושיים של<em> Aplysia californica</em> להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic
Summary
אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית<em> Aplysia</em> אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.
Abstract
יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.
Introduction
רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית 7, 8. מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר 'קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד 10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות 21 .
אנחנו ואחרים 1, 3, 6, 14, 15, 16, ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד> קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה.
טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה.
פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מומן על ידי NIH P40 OD010952, קרן Korein, אוניברסיטת מיאמי המלגה לSLC ואחוות Maytag לATK. המחברים תודה להכיר את צוות של המשאבים הלאומי לAplysia, כמו גם לורן Simonitis וחנה פק, שסיפק micrographs לדמות.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
