Isolatie van sensorische neuronen van<em> Aplysia californica</em> Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents
Summary
We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene zeehaas<em> Aplysia</em> Na de anesthesie, de isolatie van neuronen voor de korte termijn-weefselkweek, en de opnames van enkele cel ionstromen via de patch clamp techniek.
Abstract
De marine buikpotigeweekdier Aplysia californica heeft een eerbiedwaardige geschiedenis als een model van de werking van het zenuwstelsel, met bijzondere betekenis in studies van leren en geheugen. De typische voorbereidingen voor dergelijke studies zijn die waarin de sensorische en motorische zenuwcellen intact worden gelaten in een minimaal ontleed dier, of een technisch ingewikkelde neuronale co-cultuur van individuele sensorische en motorische zenuwcellen. Minder vaak voorkomende is de geïsoleerde neuronale preparaat waarin kleine clusters van nominaal homogene neuronen kunnen worden gescheiden in afzonderlijke cellen in korte termijn cultuur. Dergelijke geïsoleerde cellen zijn bruikbaar voor de biofysische analyse van ionen stromen met patch clamp technieken en doelgerichte modulatie van deze geleidingen. Een protocol voor het bereiden van dergelijke culturen wordt beschreven. Het protocol maakt gebruik van de gemakkelijk te herkennen glutamatergic sensorische neuronen van de pleura en buccale ganglia, en beschrijft hun dissociatie en minimaal onderhoud in cultuur voor meerdere dagen zonder serum.
Introduction
De marine opistobranch weekdier, Aplysia, is een nuttig neurobiologische model voor vele decennia. Het is het best bekend als een model van gewenning en klassieke conditionering 7, 8. Studies over leren en geheugen in dit model won de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 2000 voor Eric R. Kandel, in een prijs die hij met Arvid Carlsson en Paul Greengard 10 gedeeld. Deze onderzoeken met elektrische opnames van verminderde preparaten, waarbij elementen van het zenuwstelsel van de invertebrate worden ontleed uit het dier met zenuwen en spieren laat zitten, hebben geholpen verduidelijken de rol van individuele neuronen in Aplysia. Identificatie van precieze moleculaire mechanismen die leren in Aplysia vormen echter vaak gebruikt een andere techniek, langdurige co-kweken van een sensorisch neuron en een motorisch neuron, verkregen een voor een individuele donor dieren mogen een synaps vormen in de kweekschaal 21 .
Wij en anderen 1, 3, 6, 14, 15, 16 hebben het gemak waarmee geïdentificeerde neuronen kan worden gericht in dit model en de duurzaamheid op lange termijn experimenten gedissocieerde korte termijn kweken clusters van nominaal homogene neuronen benut waarin bestuderen we ionenstromen onder spanning klem in de patch clamp configuratie. Veel Aplysia neuronen opstaan om herhaalde rondes van patch klemmen om tijd te geven voor een langdurige experimentele manipulaties. De techniek is nuttig voor neuronen zoals neuro-zak cellen van de abdominale ganglion en de sensorische neuronen van de pleurale buccale ganglia waarvan dissociatie hier bedoeld maar niet voor zeer grote neuronen> 60 urn diameter, zoals L7 of R2 van de buik ganglion. We hebben geen gebruik Aplysia serum in onze culturen, in tegenstelling tot de sensorische motoneuron co-kweken elders beschreven. De meeste neuronen verkregen met deze werkwijze zal worden zonder processen thij voor het eerst 48 uur in de cultuur, het vergemakkelijken van whole cell voltage-opname, maar zal dan ontkiemen en uitwerken axonen en andere processen gedurende ongeveer 14 dagen alvorens te sterven door gebrek aan voedingsstoffen en / of groeifactoren.
Deze techniek produceert primaire culturen van 50-100 neuronen per gerecht uit fysiologisch gedocumenteerde regio's van de buccale en pleura ganglia. Dit protocol is nuttig voor onderzoekers bestuderen aspecten van enkele cel fysiologie in experimenten die vereisen talrijke experimentele duplo's per dier. Het produceert twee dezelfde culturen vanwege de anatomische scheiding van doelcellen in linker en rechter hemiganglia, waardoor studies die profiteren matched behandeling en controle culturen.
Het protocol richt buccale S cluster (BSC) neuronen van de buccale ganglion, en pleurale ventrocaudale (PVC) neuronen van de pleura ganglion. Deze cellen zijn een geschikte grootte voor gehele cel spanning opnamen en weergave Robust glutamatergic reacties. De besproken werkwijze is geschikt voor de meeste ganglia in het Aplysia zenuwstelsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dissociatie hier beschreven technieken opleveren sensorisch neuron kweken die 50-100 geïsoleerde neuronen afgewisseld met kleine aantallen glia en andere niet-geïdentificeerde cellen. De meest kritische stappen in het protocol zijn de tijd de ganglia blijven enzymoplossing en vegen, de dissociatie van de gedigereerde cel clusters splitsen de cluster in individuele cellen. Enzym digestie (stap 1.8) moet worden geoptimaliseerd op beschikbare temperatuur. Bij 23 ° C onder langzaam schudden 13 uur is voldoende voor di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gefinancierd door NIH P40 OD010952, de Korein Foundation, een universiteit van Miami Fellowship naar SLC en een Maytag fellowship aan ATK. De auteurs zeer erkentelijk voor het personeel van de National Resource voor Aplysia, evenals Lauren Simonitis en Hannah Peck, die microfoto van een cijfer voorzien.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
