La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em> En el útero</em> La electroporación
Summary
A pesar de la importancia clínica y funcional del hipotálamo,<em> En el útero</em> Manipulación genética de su desarrollo rara vez se ha intentado. Te mostramos un procedimiento detallado para<em> En el útero</em> Electroporación en el hipotálamo del ratón y muestran resultados representativos de transfección hipotálamo total y parcial (regional).
Abstract
La modificación genética de regiones específicas del cerebro de los mamíferos es el desarrollo de un enfoque experimental muy potente. Sin embargo, la generación de nuevos mutantes de ratón suele ser lento y frustrante. Se ha demostrado que el acceso al cerebro de ratón en desarrollo en el útero con la supervivencia post-operatoria razonable es posible. Sin embargo, los resultados de este procedimiento se han reportado casi exclusivamente para la parte más superficial y de fácil acceso del cerebro en desarrollo, es decir, la corteza. El tálamo, una región más estrecha y más medial, ha resultado más difícil objetivo. Transfección en los núcleos más profunda, especialmente aquellos del hipotálamo, es quizás los resultados más difíciles y por lo tanto, muy pocos han sido reportados. Aquí se demuestra un procedimiento para orientar todo el neuroepitelio hipotalámica o parte de él (regiones hipotalámicas) para la transfección por medio de electroporación. Las claves de nuestro enfoque ya narcosis tiempos, inyección en el third ventrículo, y amable y la colocación de los electrodos apropiados. Además, mostramos los resultados de la focalización y el posterior análisis histológico del núcleo hipotalámico más rebajada, el cuerpo mamilares.
Introduction
La manipulación genética del cerebro de ratón embrionario es un enfoque preferido para aprender acerca de la regulación del desarrollo. La generación de líneas de ratones mutantes sin embargo, es lento y caro. Un método poderoso para introducir cambios genéticos específicos en el desarrollo de las neuronas del cerebro de mamífero es la electroporación en el útero. Esencialmente, la técnica consiste en transfectar ADN en el neuroepitelio embrionario del cerebro por medio de impulsos eléctricos, a continuación, permitiendo que el embrión para sobrevivir durante un cierto período de tiempo, recoger el cerebro y examinarlas para su posible novela, fenotipos informativos. De esta manera, el experimentador puede probar hipótesis casi de inmediato y sin los largos períodos de espera necesarios para la producción de mutantes de ratón.
La transfección de ADN en embriones en desarrollo se inició con la electroporación in ovo en embriones de pollo 1. La prueba de concepto esencial para el ratón se realizó en la cultura <shasta> 2. Esto fue seguido por las primeras descripciones de la técnica en el ratón en el útero 3,4.
El principal problema es para transfectar el cerebro en desarrollo de los embriones en el útero sin matarlos o de la madre. Aprender a realizar la cirugía necesaria (laparotomía, inyección, electroporación) requiere un largo periodo de entrenamiento. Una vez que la cirugía ha sido dominado hasta el punto en que la tasa de supervivencia embrionaria es aceptable, la pregunta clave es: ¿qué estructuras cerebrales son accesibles? No es sorprendente que los primeros trabajos publicados que muestran los resultados obtenidos con la electroporación in utero se centraron en el desarrollo cortical 5-9. Esto sigue siendo cierto para la mayoría de las publicaciones utilizando esta técnica, ya que la región del cerebro de ratón en desarrollo más accesible a los procedimientos quirúrgicos es la corteza (Figura 1). El procedimiento para la electroporación en el útero en la corteza ha sido descritaen la prensa 10 y 11 a 14 en el vídeo. Una modificación de la técnica se puede utilizar para tratar una parte ventral del telencéfalo, los ganglios basales 15.
Más allá del telencéfalo, el diencéfalo (clásicamente dividido en tálamo y el hipotálamo) es una región del cerebro anterior más difícil de alcanzar. Un pequeño número de documentos de informes dirigidos a su parte dorsal y más accesible, el tálamo 16-19.
El hipotálamo es la parte más ventral del cerebro anterior, por lo tanto, el uno localizada más profundamente a partir de la superficie dorsal (corteza) (Figura 1). Esta región sigue siendo un reto difícil para los investigadores comprometidos para manipular genéticamente el cerebro del ratón en el útero. Hasta donde sabemos, sólo muy pocos artículos informen sobre los resultados de la transfección útero en el hipotálamo de ratón 20,21. Sin embargo, la importancia funcional del hipotálamo Cañot ser exagerada, ya que regula los comportamientos como comer y beber, el apareamiento, la reproducción y crianza de los hijos 22. Por otra parte, las alteraciones en el desarrollo hipotalámico contribuyen a originar más adelante en las condiciones de vida como la obesidad, la hipertensión, la diabetes y la pubertad precoz 23. Ser capaz de alterar genéticamente el hipotálamo durante el desarrollo sería una herramienta muy poderosa para entenderlo.
El protocolo quirúrgico básico para la laparotomía de ratones embarazadas que usamos aquí es similar a la utilizada en otros protocolos 11,13,14,24. Vamos a describir aquí brevemente para completar. Clave para nuestro procedimiento, por otro lado, son del tipo de anestesia, el lugar de la inyección, el tipo de electrodos y la inserción y la posición del electrodo positivo con respecto a la cabeza del embrión. Nosotros preferimos para inducir y mantener la anestesia por inhalación de gas sobre la anestesia intraperitoneal sencilla, ya que el primero permite laperíodos algo más largos de la narcosis necesarios para una cirugía difícil. Resultados inhalación isoflurano en la recuperación más rápida de la anestesia, ya que por lo general la madre demuestra un comportamiento normal ya minutos después de la cirugía. El punto más fácil de la inyección de la solución de ADN con la micropipeta de vidrio es el ventrículo lateral, que sin embargo es completamente inadecuado para la electroporación hipotálamo. Inyección directa en el tercer ventrículo es de hecho fundamental orientar la diencephalic estructuras profundas. Es posible transfectar del hipotálamo o de E12.0 E12.5 con electrodos estándar, off-the-shelf. Hemos encontrado algunos de los electrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japón) particularmente adecuado para este propósito.
Con nuestro procedimiento se obtiene la transfección de todo el neuroepitelio hipotalámica o, transfección regional parcial dependiendo de la orientación del electrodo. Aquí se demuestra la técnica mediante la transfección del cuerpo mammillary, podría decirse quela más profunda y rebajada de todos los núcleos hipotalámicos. Además, se muestra el análisis histológico detallado de las células transfectadas hacia abajo hasta el nivel celular de la resolución.
Una comparación de la electroporación en el útero con otros enfoques para transfectar el cerebro en desarrollo en el útero del ratón se puede encontrar en la sección de Discusión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Acerca de la anestesia: Desde electroporación en el útero en el hipotálamo puede ser técnicamente difícil y requerir tiempos más largos narcosis, preferimos para inducir y mantener la anestesia mediante la administración de una mezcla de oxígeno e isoflurano. En nuestra experiencia, los animales se mantienen adecuadamente anestesiado de esta manera por períodos de hasta una hora por lo menos, la recuperación de la madre es muy rápido, y la supervivencia de los embriones mejorar. Otros enfoques para l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
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