מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em> ברחם</em> Electroporation
Summary
למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס,<em> ברחם</em> מניפולציה גנטית של הפיתוח שלה כבר ניסה רק לעתים נדירות. אנחנו מראים נוהל מפורט ל<em> ברחם</em> Electroporation ליפותלמוס העכבר ותוצאות נציג מופע של transfection (אזורי) ההיפותלמוס המוחלט והחלקית.
Abstract
שינוי גנטי של אזורים מסוימים במוח היונקים הפיתוח הוא גישה ניסויית חזקה מאוד. עם זאת, יצירת מוטציות עכבר רומן היא לעתים קרובות מתסכל איטית. הוכח כי הגישה למוח העכבר מתפתח ברחם בהישרדות לאחר ניתוח סביר אפשרית. ובכל זאת, עם תוצאות הליך זה כבר דיווח כמעט אך ורק לחלק השטחי ביותר ונגיש של המוח המתפתח, כלומר את קליפת המוח. התלמוס, אזור צר יותר ויותר המדיאלי, הוכיח קשה יותר ליעד. Transfection לגרעינים עמוקים יותר, במיוחד אלה של ההיפותלמוס, הוא אולי כבר דיווח על התוצאות המאתגרות ביותר, ולכן מעטים מאוד. כאן אנו מדגימים הליך למקד neuroepithelium ההיפותלמוס כולו או חלק ממנו (אזורי ההיפותלמוס) לtransfection באמצעות electroporation. המפתחות לגישה שלנו הם יותר הרדמת פעמים, הזרקה בtתוכי חדר, ואדיב ומיקום של האלקטרודות מתאימים. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של מיקוד והניתוח היסטולוגית הבא של גרעין ההיפותלמוס השקוע ביותר, הגוף הפיטמתיים.
Introduction
מניפולציה גנטית של מוח העכבר העוברי היא גישה מועדפת כדי ללמוד על רגולציה התפתחותית. הדור של קווי עכבר מוטציה עם זאת הוא איטי ויקר. שיטה רב עוצמה אחד כדי להציג את השינויים גנטיים ספציפיים בפיתוח תאי עצב במוח היונקים היא electroporation ברחם. בעיקרו של דבר, הטכניקה מורכבת transfecting דנ"א לתוך neuroepithelium המוח העוברי באמצעות פולסים חשמליים, ולאחר מכן מאפשר לעובר לשרוד לתקופה מסוימת של זמן, לאסוף את המוח ולבחון אותם לרומן אפשרי, פנוטיפים אינפורמטיבי. בדרך זו, הנסיין יכול לבחון השערות באופן כמעט מיידי ללא תקופות המתנה הארוכות הנדרשות לייצור מוטציות עכבר.
Transfection של ה-DNA לעוברי מתפתחים התחיל עם ב electroporation אובו בעוברי 1 חומוס. הוכחה של הקונספט החיוני לעכבר בוצע בתרבות <sעד> 2. זה היה זמן קצר אחריו את התיאורים הראשונים של הטכניקה על העכבר ברחם 3,4.
הבעיה העיקרית היא transfect המוח של עוברים מתפתחים ברחם בלי להרוג אותם או האם. למידה כדי לבצע את הניתוח הדרוש (laparotomy, זריקה, electroporation) דורשת תקופת הכשרה ארוכה. לאחר הניתוח כבר שולט לנקודה שבה יחס הישרדות העובר מקובל, שאלת המפתח הבאה היא: שהמבנים מוחיים נגישים? באופן לא מפתיע, את המסמכים הראשונים שפורסמו מראים תוצאות שהושגו עם electroporation ברחם מתמקדים בהתפתחות קליפת המוח 5-9. זה עדיין נכון עבור רוב הפרסומים באמצעות טכניקה זו, שכן האזור במוח העכבר מתפתח הנגיש ביותר לפרוצדורות כירורגיות הוא קליפת המוח (איור 1). ההליך לelectroporation ברחם לתוך קליפת המוח תוארבדפוס 10 ובוידאו 11-14. שינוי של הטכניקה יכול לשמש יעד חלק הגחון של telencephalon, גרעיני בסיס 15.
מעבר telencephalon, diencephalon (מחולק באופן קלאסי לתלמוס וההיפותלמוס) הוא אזור של המוח הקדמי יותר הקשה להגיע. מספר קטן של דיווחי ניירות מיקוד של חלק הגבי ונגיש ביותר שלו, התלמוס 16-19.
ההיפותלמוס הוא חלק הגחון ביותר של המוח הקדמי, ולכן אחד מקומי בצורה העמוקה ביותר מהמשטח הגבי (קליפת המוח) (איור 1). אזור זה עדיין מהווה אתגר קשה לחוקרים שביצעו כדי לתפעל את מוח העכבר ברחם מבחינה גנטית. למיטב ידיעתנו, רק מעט מאוד מאמרים מדווחים על התוצאות בtransfection הרחם אל ההיפותלמוס עכבר 20,21. עם זאת, חשיבותו התפקודית של canno ההיפותלמוסלא להיות מוגזם, שכן הוא מסדיר התנהגויות כמו אכילה ושתייה, חיזור, רבייה והורות 22. יתר על כן, שינויים בפיתוח ההיפותלמוס לתרום למקורן מאוחר יותר בתנאי חיים כמו השמנה, יתר לחץ דם, סוכרת ומפותחת לגיל התבגרות 23. היכולת לשנות גנטי ההיפותלמוס במהלך הפיתוח הייתי לספק כלי חזק מאוד כדי להבין את זה.
הפרוטוקול כירורגית הבסיסית לlaparotomy של עכברים הרה שאנו משתמשים כאן דומה לזה המשמש בפרוטוקולים אחרים 11,13,14,24. נתאר אותן כאן בקצרה לשלמות. מפתח להליך שלנו, לעומת זאת, הם הסוג של הרדמה, את מקומה של זריקה, הסוג של אלקטרודות והחדרה ומיקום של האלקטרודה החיובית ביחס לראשו של העובר. אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות שאיפת גז על פני הרדמה intraperitoneal פשוטה, שכן לשעבר מאפשריםתקופות ממושכות יותר של הרדמה נדרשות לניתוח קשה. תוצאות isoflurane משאיפת בהתאוששות מהירה יותר מהרדמה, שכן לרוב האם מדגים התנהגות נורמלית כבר דקות לאחר הניתוח. הנקודה הקלה ביותר של זריקה של פתרון ה-DNA עם micropipette הזכוכית היא החדר לרוחב, שעם זאת היא אינו מתאים לחלוטין ליפותלמוס electroporation. הזרקה ישירות בחדר השלישי היא אכן חיונית כדי למקד מבני diencephalic עמוקים. אפשר transfect ההיפותלמוס מE12.0 או E12.5 עם אלקטרודות סטנדרטיות, ה-off-מדף. מצאנו כמה אלקטרודות שיוצרו על ידי NEPA ג'ין (צ'יבה, יפן) המתאימים במיוחד למטרה זו.
עם ההליך שלנו אנו מקבלים transfection של neuroepithelium ההיפותלמוס השלם או החלקית transfection האזורית, בהתאם לאורינטציה של האלקטרודה. כאן אנו מדגימים את הטכניקה על ידי transfecting הגוף הפיטמתיים, ללא ספקהעמוק ביותר והשקוע ביותר של כל גרעיני ההיפותלמוס. בנוסף, אנו מציגים ניתוח היסטולוגית מפורט של תאי transfected עד לרמה התאית של רזולוציה.
ניתן למצוא השוואה של electroporation ברחם עם גישות אחרות לtransfecting המוח המתפתח העכבר ברחם בסעיף הדיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
לגבי ההרדמה: מאז electroporation ברחם ליפותלמוס יכול להיות מבחינה טכנית מפרך ודורש פעמים הרדמה ארוכות יותר, אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות ממשל מתערובת של חמצן וisoflurane. מניסיוננו, חיות יכולות להישאר כראוי מורדמות בדרך זו לתקופות של עד שעה אחת לפחות, ההתאושש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמני (דויטשה Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
