La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso<em> In utero</em> Elettroporazione
Summary
Nonostante l'importanza funzionale e mediche dell'ipotalamo,<em> In utero</em> Manipolazione genetica del suo sviluppo è stato raramente tentata. Mostriamo una procedura dettagliata per<em> In utero</em> Elettroporazione nell'ipotalamo mouse e mostrano risultati rappresentativi (regionale) trasfezione ipotalamo totale e parziale.
Abstract
Modificazione genetica di specifiche regioni del cervello dei mammiferi è sviluppare un approccio sperimentale molto potente. Tuttavia, generando nuovi mutanti di topo è spesso frustrante lentezza. È stato dimostrato che l'accesso al cervello di sviluppo del mouse in utero con ragionevole sopravvivenza post-operatoria è possibile. Ancora, risultati con questa procedura sono stati riportati quasi esclusivamente per la parte più superficiale e facilmente accessibile del cervello di sviluppo, cioè la corteccia. Il talamo, una regione stretto e più mediale, è dimostrato più difficile da bersaglio. Trasfezione in nuclei più profondo, specialmente quelli dell'ipotalamo, è forse il risultato più impegnative e, pertanto, molto pochi sono stati segnalati. Qui mostriamo una procedura per individuare l'intera neuroepitelio ipotalamica o parte di essa (regioni ipotalamiche) per trasfezione mediante elettroporazione. Le chiavi del nostro approccio sono più volte narcosi, l'iniezione in tHird ventricolo, e tipo e posizionamento degli elettrodi appropriata. Inoltre, vi mostriamo i risultati di targeting e la successiva analisi istologica del nucleo ipotalamico più incassata, il corpo mammillary.
Introduction
Manipolazione genetica del cervello di topo embrionale è un approccio preferito per conoscere regolazione dello sviluppo. La generazione di linee mutanti topo però è lento e costoso. Un metodo efficace per introdurre specifici cambiamenti genetici nello sviluppo di neuroni del cervello dei mammiferi è elettroporazione in utero. In sostanza, la tecnica consiste transfecting DNA nel cervello embrionale neuroepithelium mediante impulsi elettrici, consentendo quindi l'embrione di sopravvivere per un certo periodo di tempo, raccogliere il cervello e li esamini per possibili romanzo, fenotipi informativi. In questo modo, l'sperimentatore può verificare ipotesi quasi immediatamente senza i lunghi periodi di attesa necessari per la produzione di mutanti di topo.
Trasfezione di DNA in via di sviluppo è iniziato con embrioni in elettroporazione ovo su embrioni di pollo 1. L'essenziale proof-of-concept per il mouse è stata eseguita in cultura <sup> 2. Questo è stato presto seguito dalle prime descrizioni della tecnica del mouse in utero 3,4.
Il problema principale è quello di transfettare il cervello di embrioni in via di sviluppo in utero senza ucciderli o della madre. Apprendimento per eseguire l'intervento necessario (laparotomia, iniezione, elettroporazione) richiede un lungo periodo di formazione. Una volta che l'intervento chirurgico è stato masterizzato al punto in cui il rapporto di sopravvivenza degli embrioni è accettabile, la prossima domanda chiave è: quali strutture cerebrali sono accessibili? Non a caso, i primi documenti pubblicati mostrano risultati ottenuti con elettroporazione in utero focalizzati su sviluppo corticale 5-9. Questo è ancora vero per la maggior parte delle pubblicazioni utilizzando questa tecnica, poiché la regione del cervello di sviluppo del mouse più accessibile per procedure chirurgiche è la corteccia (Figura 1). La procedura per elettroporazione in utero nella corteccia è stata descrittain stampa 10 e in video 11-14. Una modifica della tecnica può essere utilizzata per indirizzare una parte ventrale del telencefalo, i gangli della base 15.
Al di là del telencefalo, il diencefalo (classicamente suddiviso in talamo e ipotalamo) è una regione del prosencefalo più difficile da raggiungere. Un piccolo numero di documenti di report di targeting della sua parte dorsale e più accessibile, il talamo 16-19.
L'ipotalamo è la parte più ventrale del prosencefalo, quindi quello localizzato più profondamente dalla superficie dorsale (corteccia) (Figura 1). Questa regione rimane una sfida difficile per i ricercatori impegnati a manipolare geneticamente il cervello di topo in utero. A nostra conoscenza, solo pochissimi articoli riferire sui risultati di in utero trasfezione nell'ipotalamo del mouse 20,21. Tuttavia, l'importanza funzionale dell'ipotalamo cannot essere sottovalutata, in quanto regola i comportamenti come il mangiare e il bere, l'accoppiamento, l'allevamento e la genitorialità 22. Inoltre, alterazioni dello sviluppo dell'ipotalamo contribuiscono ad originare in seguito a condizioni di vita come l'obesità, l'ipertensione, il diabete e la pubertà precoce 23. Essere in grado di modificare geneticamente l'ipotalamo durante lo sviluppo potrebbe fornire uno strumento molto potente per capirlo.
Il protocollo chirurgico di base per la laparotomia di topo gravide che utilizziamo qui è simile a quella utilizzata in altri protocolli 11,13,14,24. Noi li descrivono brevemente qui per completezza. Chiave del nostro procedimento, invece, sono il tipo di anestesia, il luogo di iniezione, del tipo di elettrodi e l'inserimento e la posizione dell'elettrodo positivo rispetto alla testa del embrione. Preferiamo indurre e mantenere l'anestesia per inalazione gas su semplice anestesia intraperitoneale, poiché il primo consente l'un po 'più lunghi periodi di narcosi necessari per un intervento chirurgico difficile. Risultati inalazione isoflurano in veloce recupero dall'anestesia, dal momento che di solito la madre dimostra un comportamento normale già minuti dopo l'intervento chirurgico. Il più facile punto di iniezione della soluzione di DNA con la micropipetta di vetro è il ventricolo laterale, che però è completamente inadatto per ipotalamo elettroporazione. Iniezione diretta del terzo ventricolo è infatti cruciale per indirizzare le strutture diencefaliche profonde. È possibile trasfettare all'ipotalamo da E12.0 E12.5 o con elettrodi standard, off-the-shelf. Abbiamo trovato alcuni degli elettrodi fabbricati da Nepa Gene (Chiba, Giappone) particolarmente adatta a questo scopo.
Con la nostra procedura otteniamo trasfezione di tutta neuroepitelio ipotalamica o parziale, trasfezione regionale a seconda dell'orientamento elettrodo. Qui mostriamo la tecnica transfettando corpo mammillary, discutibilmenteil più profondo e incasso di tutti i nuclei ipotalamici. Inoltre, mostriamo analisi istologica dettagliata delle cellule trasfettate giù al livello cellulare di risoluzione.
Un confronto di elettroporazione in utero ad altri procedimenti di trasfezione sviluppo cerebrale topo in utero può essere trovata nella sezione di discussione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Circa l'anestesia: Poiché elettroporazione in utero nell'ipotalamo può essere tecnicamente ardua e richiedono tempi più lunghi narcosi, preferiamo indurre e mantenere l'anestesia mediante somministrazione di una miscela di ossigeno e isoflurano. Nella nostra esperienza, gli animali possono rimanere adeguatamente anestetizzato in questo modo, per periodi fino a un'ora almeno, la ripresa della madre è molto veloce, e la sopravvivenza dell'embrione migliorata. Altri approcci per l'anest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla German Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
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