Summary

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em> في الرحم</em> Electroporation

Published: July 24, 2013
doi:

Summary

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت المهاد،<em> في الرحم</emوقد حاول نادرا> التلاعب الجيني من تطورها. نعرض إجراء مفصل ل<em> في الرحم</em> electroporation في منطقة ما تحت المهاد الماوس وتظهر نتائج ممثلة من الكل والجزئي ترنسفكأيشن طائي (الإقليمية).

Abstract

التعديل الوراثي للمناطق معينة من أدمغة الثدييات النامية هو المنهج التجريبي قوية جدا. ومع ذلك، وتوليد المسوخ الماوس الرواية غالبا ما تكون بطيئة بشكل محبط. ولقد ثبت أن الوصول إلى مخ الفأر النامية في الرحم مع بقاء ما بعد الجراحة معقول هو ممكن. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج مع هذا الإجراء على وجه الحصر تقريبا في معظمها سطحية ويمكن الوصول إليها بسهولة من الدماغ النامية، أي القشرة. وقد ثبت المهاد، وهي منطقة أضيق وأكثر وسطي، أكثر صعوبة لهدف. ترنسفكأيشن لتكوين نواة أكثر عمقا، خصوصا تلك من منطقة ما تحت المهاد، وربما تم الإبلاغ عن النتائج الأكثر تحديا، وبالتالي عدد قليل جدا. هنا علينا أن نبرهن إجراء لاستهداف الظهارة العصبية طائي بأكمله أو جزء منه (المناطق طائي) لترنسفكأيشن من خلال electroporation. مفاتيح لنهجنا الأوقات الخدر لفترة أطول، حقن في تيهيرد البطين، ونوع وتحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا نتائج الاستهداف والتحليل النسيجي لاحقة من نواة تحت المهاد البصري الأكثر راحة، والجسم الحلمي.

Introduction

التلاعب الجيني للدماغ الفأر الجنينية هو النهج المفضل لمعرفة المزيد عن تنظيم التنموية. الجيل من خطوط الماوس متحولة ولكن هو بطيئة ومكلفة. واحد طريقة قوية لإدخال تغييرات جينية محددة في تطوير الخلايا العصبية للدماغ الثدييات هو electroporation في الرحم. أساسا، تتكون هذه التقنية من transfecting الحمض النووي في الظهارة العصبية الجنينية الدماغ عن طريق نبضات كهربائية، ثم السماح الجنين إلى البقاء على قيد الحياة لفترة معينة من الزمن، وجمع الدماغ ودراستها لرواية ممكن، الظواهر غنية بالمعلومات. في هذه الطريقة، يمكن للمجرب اختبار الفرضيات على الفور تقريبا دون فترات انتظار طويلة اللازمة لإنتاج المسوخ الماوس.

التي ترنسفكأيشن من الحمض النووي في الأجنة النامية مع electroporation في البيضة على افراخ الدجاج 1. تم إجراء إثبات صحة مفهوم أساسي للماوس في الثقافة <sتصل> 2. وسرعان ما أعقب ذلك الأوصاف الأولى من هذه التقنية علي الفار في الرحم 3،4.

والمشكلة الرئيسية هي لبالنقل دماغ الأجنة النامية في الرحم دون قتلهم أو الأم. تعلم لإجراء الجراحة اللازمة (البطن، والحقن، electroporation) يتطلب فترة تدريب طويلة. بمجرد يتقن عملية جراحية لنقطة حيث نسبة البقاء على قيد الحياة الجنين غير مقبول، فإن السؤال الرئيسي التالي هو: ما هي هياكل الدماغ يمكن الوصول إليها؟ ليس من المستغرب، أول الأبحاث المنشورة تظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع electroporation في الرحم تركز على التنمية القشرية 5-9. هذا لا يزال صحيحا بالنسبة لمعظم المنشورات باستخدام هذه التقنية، منذ المنطقة من الدماغ الماوس النامية الأكثر متناول العمليات الجراحية هي القشرة (الشكل 1). وقد وصفت الإجراء لelectroporation في الرحم في اللحاءفي الطباعة 10 و 11-14 في الفيديو. وهناك تعديل لهذه التقنية يمكن استخدامها لاستهداف جزء البطنية من الدماغ الانتهائي، والعقد القاعدية 15.

ما وراء الدماغ الانتهائي، والدماغ البيني (مقسمة تقليديا إلى المهاد المهاد و) هي منطقة من الدماغ الأمامي من الصعب الوصول إليها. وهناك عدد قليل من التقارير أوراق استهداف جانبها الظهرية والتي يمكن الوصول إليها، المهاد 16-19.

ما تحت المهاد هو الجزء الأكثر البطنية من الدماغ الأمامي، وبالتالي فإن واحدة المترجمة معظم عميق من السطح الظهري (اللحاء) (الشكل 1). لا تزال هذه المنطقة تحديا صعبا للباحثين ملتزمة التلاعب وراثيا مخ الفأر في الرحم. على حد علمنا، يقدم سوى عدد قليل جدا مقالات عن نتائج في ترنسفكأيشن الرحم في منطقة ما تحت المهاد الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن أهمية وظيفية من منطقة ما تحت المهاد المدفعر يكون مبالغا فيه، لأنه ينظم السلوكيات مثل الأكل والشرب، والتزاوج والتربية والأبوة والأمومة 22. وعلاوة على ذلك، وتعديلات في التنمية طائي تسهم أن تنشأ لاحقا في ظروف الحياة مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم والسكري والبلوغ المبكر 23. سوف تكون قادرة على تغيير وراثيا تحت المهاد خلال تنمية تقدم أداة قوية جدا لفهم ذلك.

بروتوكول الجراحية الأساسية لفتح البطن من الفئران الحوامل التي نستخدمها هنا هي مماثلة لتلك المستخدمة في البروتوكولات الأخرى 11،13،14،24. سنقوم بشرح منهم هنا لفترة وجيزة للتأكد من اكتمالها. مفتاح الإجراء لدينا، من ناحية أخرى، هي نوع من التخدير، ومكان الحقن، نوع من الأقطاب الكهربائية والإدراج والموقف من القطب الموجب فيما يتعلق رأس الجنين. ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال استنشاق الغاز على تخدير داخل الصفاق بسيطة، منذ السابق يسمح للفترات أطول نوعا من الخدر اللازمة لعملية جراحية صعبة. النتائج استنشاق isoflurane والانتعاش في أسرع من التخدير، منذ يوضح عادة الأم السلوك العادي بالفعل دقائق بعد الجراحة. أسهل نقطة الحقن من الحل DNA مع الزجاج micropipette هو البطين الجانبي، والتي مع ذلك غير مناسب تماما ل electroporation تحت المهاد. حقن مباشرة في البطين الثالث هو في الواقع حاسمة لاستهداف هياكل الدماغ البيني عميق. فمن الممكن لبالنقل منطقة ما تحت المهاد من E12.0 أو E12.5 مع معيار، أقطاب قبالة الجاهزة للاستخدام. لقد تم العثور على بعض من الأقطاب الكهربائية المصنعة من قبل نيبا جين (تشيبا، اليابان) مناسبة خاصة لهذا الغرض.

مع إجراءاتنا نحصل على ترنسفكأيشن من الظهارة العصبية طائي كامل أو جزئي ترنسفكأيشن الإقليمية، اعتمادا على اتجاه القطب. نحن هنا لشرح هذه التقنية عليها بنقل الجسم الحلمي، يمكن القولأعمق وأكثر راحة من كل نواة تحت المهاد البصري. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا التحليل النسيجي مفصل لالخلايا transfected وصولا الى المستوى الخلوي من القرار.

مقارنة بين electroporation في الرحم مع المناهج الأخرى لtransfecting البلدان النامية مخ الفأر في الرحم يمكن العثور عليها في الجزء المتعلق بالمناقشة.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي وزجاج بال micropipettes للحقن نوعية جيدة بال micropipettes الزجاج ضرورية للحد من ارتفاع نسبة الإجهاض الأولي بسبب فقدان السائل الذي يحيط بالجنين. الإجراء لسحب بال micropipettes الزجاج تم توثيقه جيدا 13،18،25. است?…

Representative Results

يولد معظم الخلايا العصبية تحت المهاد بين E11.5 إلى E15.2، وفقا لتحليل الميلاد التي يرجع تاريخها في الفئران 26 ترجمتها إلى تطوير الماوس أقصر إلى حد ما 27،28. يتم الوصول إلى الذروة من تكوين الخلايا العصبية طائي في E12.5 29-31. وفقا لذلك، في سن ترنسفكأيشن الذي تم اخ?…

Discussion

حول التخدير: منذ electroporation في الرحم في منطقة ما تحت المهاد يمكن أن تكون شاقة تقنيا وتتطلب مرات الخدر لفترة أطول، ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال الإدارة من خليط من الأكسجين وisoflurane و. في تجربتنا، ويمكن أن تبقى الحيوانات مخدرة بشكل مناسب في هذه الطريقة لف?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث).

Materials

      REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH   anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH   anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer   non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma   opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer    
      EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Play Video

Cite This Article
Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

View Video