視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、<em>子宮内</emその開発の>遺伝子操作はほとんど試みられていない。私たちは、の詳細な手順を示す<em>子宮内</em>マウスの視床下部へのエレクトロポレーションと合計と部分(地域)視床下部のトランスフェクションの代表的な結果を示しています。
開発哺乳類の脳の特定の領域の遺伝子組み換えは非常に強力な実験的なアプローチです。しかし、小説のマウス変異体を生成することはしばしばいらいら遅いです。これは、合理的なポスト手術用生存率と子宮内現像マウスの脳へのアクセスが可能であることが示されている。それでも、この手順と結果は脳の発達の最も表面的かつ簡単にアクセスできる部分はほぼ全面的に報告されており、皮質、すなわち 。視床、狭く、より内側の領域は、ターゲットへのより困難であることが判明しました。特に深い核、視床下部のものへのトランスフェクションは、最も困難なので、非常にいくつかの結果が報告されているかもしれないです。ここでは、全体の視床下部の神経上皮またはエレクトロを通じてトランスフェクションのためにその一部を(視床下部の領域)が対象とする手順を示しています。我々のアプローチの鍵は、長い昏睡回、T中の注射ですhird心室、適切な種類と電極の位置。さらに、我々はターゲティング最も凹ん視床核、乳頭体のその後の組織学的分析の結果を示す。
マウス胎児の脳の遺伝子操作が発達規制について学ぶために好ましいアプローチである。変異マウス線の生成は、しかし遅く、高価である。哺乳類の脳の神経細胞の開発に特定の遺伝的変化を導入する一つの有力な方法は、 子宮内エレクトロポレーションである。本質的に、この技術は、胚は、一定時間生き残る脳を収集し、可能な新規な、有益な表現型のためにそれらを調べることができ、その後、電気的パルスによって胚脳の神経上皮へのDNAのトランスフェクションから構成される。この方法では、実験者は、マウス変異体の生産に必要な長い待機期間なしでほとんど即座仮説をテストすることができます。
発展途上胚へのDNAのトランスフェクションは、ニワトリ胚1上のOVOエレクトロポレーションで始まりました。マウスに不可欠な概念実証は、文化の中で行われた<s2>まで。これは、すぐに子宮内 3,4 でマウスの技術の最初の説明が続いた。
主な問題は、それらまたは母を殺すことなく、 子宮内での開発の胚の脳をトランスフェクトすることです。必要な手術(開腹、インジェクション、エレクトロポレーション)を実行するために学ぶことは、長い訓練期間を必要とします。手術が胚の生存率が許容できるポイントに習得された後、次の重要な問題は、次のとおりです。脳構造がアクセス可能である?驚くことではないが、 子宮内エレクトロポレーションで得られた結果を示した最初の論文は、皮質開発5-9に焦点を当てた。外科的処置に最もアクセス現像マウス脳の領域が皮質( 図1)であるので、これは、この技術を用いて出版物のほとんどは依然として当てはまる。皮質に子宮内エレクトロポレーションでの手順が記載されているプリント10とビデオ11〜14インチ技術の変更が終脳の腹側部分、大脳基底核15を標的するために使用することができる。
終脳を超えて、間脳は(古典的視床と視床下部に分けて)に到達することがより困難脳の領域である。その背と最もアクセス部分、視床16-19の標的論文·レポートの数が少ない。
視床下部は、脳の中で最も腹側部分であるので、1背面(皮質)( 図1)から最も深くローカライズ。この領域は、遺伝的に子宮内でマウスの脳を操作することを約束し研究者のための困難な課題である。我々の知る限りでは、ごく少数の記事では、マウスの視床下部20,21に子宮内トランスフェクションの結果を報告する。しかし、視床下部cannoの機能的重要性それは食べたり飲んだり、交配、繁殖と子育て22のような行動を規制するため、T、誇張すること。また、視床下部の開発の変化は、肥満、高血圧、糖尿病、思春期早発症23のような生活条件の後半発信に貢献しています。開発中に遺伝的に視床下部を変更することができることは、それを理解するための非常に強力なツールを提供するでしょう。
我々はここで使用している妊娠マウスの開腹するための基本的な外科的プロトコルは、他のプロトコル11,13,14,24で使用されているものと似ています。私たちは、完全を期すためにここで簡単にそれらを記述します。我々の手順の鍵と、他方では、麻酔のタイプ、注入の代わりに、電極の種類や挿入および胚の頭部に対する正電極の位置である。前者は可能にするため、我々は、単純な腹腔内麻酔上ガス吸入による麻酔を誘導し、維持することを好む難しい手術に必要な麻酔のやや長い期間。麻酔からの迅速な復旧にイソフルラン吸入結果、通常、母親は既に手術後の分を通常の動作を示しているので。ガラスマイクロピペットでDNA溶液を注入するための最も簡単な点は、しかし、視床下部のエレクトロポレーションのために完全には不向きである側脳室、です。直接第三脳室に注入は確かに深い間脳構造を標的とすることが重要です。標準の、既製の電極にE12.0またはE12.5から視床下部をトランスフェクトすることができる。私たちは、特にこの目的に適してNEPAジーン(千葉県、日本)によって製造された電極の一部を発見した。
私たちの手順では、我々は全体の視床下部神経上皮や電極の向きに応じて部分的な、地域のトランスフェクションのトランスフェクションを得る。ここで我々は間違いなく、乳頭体をトランスフェクトすることによって技術を実証深いとすべての視床核の最も凹んだ。さらに、我々は、解像度の細胞レベルにトランスフェクションされた細胞の詳細な組織学的分析を下に示す。
子宮内でマウスの脳の発達をトランスに他のアプローチと子宮内エレクトロポレーションでの比較は考察の項に記載されています。
麻酔について:視床下部に子宮内エレクトロポレーションでは技術的に困難であると長い麻酔時間を必要とすることができるので、我々は、酸素とイソフルランの混合物を投与することにより麻酔を誘導し、維持することを好む。我々の経験では、動物は少なくとも1時間までの期間について、このように適切に麻酔残ることができ、母親の回復は非常に高速であり、胚の生存率…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ドイツ研究協会(ドイツ学術振興)によって賄われていた。
REAGENTS | |||
Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
Fast Green | Fluka | 44715 | |
Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
Xylazine | Bayer | ||
EQUIPMENT | |||
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
Cryostat | Leica | CM3050S | |
Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |