Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em> In vivo</em
Summary
De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.
Abstract
Optogenetic methoden hebben zich ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van neurale circuit activiteit ten grondslag liggen aan een gevarieerde set van gedragingen in een breed scala van soorten. Optogenetic instrumenten van microbiële oorsprong bestaat uit lichtgevoelige membraan eiwitten die in staat zijn om de neurale activiteit ingenetically gedefinieerde celtypen dan gedragsmatig relevante tijdschalen activeren (bijv. channelrhodopsin-2, ChR2) of stilte (bijv. halorhodopsin, NpHR) zijn. We eerst aantonen dat er een eenvoudige benadering voor adeno-geassocieerd virus gemedieerde levering van ChR2 en NpHR transgenen aan de dorsale subiculum en prelimbische regio van de prefrontale cortex in de rat. Omdat ChR2 en NpHR genetisch richtbare beschrijven we het gebruik van deze technologie om de elektrische activiteit van specifieke populaties van neuronen (bijvoorbeeld, piramidale neuronen) ingebed in heterogene weefsel met hoge temporele precisie regelen. We beschrijven hierin de hardware, software op maatgebruikersinterface en procedures die het mogelijk maken voor gelijktijdige lichte levering en elektrische opname van getransduceerde piramidale neuronen in een verdoofde in vivo voorbereiding. Deze licht reagerende tools bieden de mogelijkheid voor het identificeren van de causale bijdragen van verschillende celtypes te informatieverwerking en gedrag.
Introduction
Het vermogen binnen een neuraal circuit in een tijdelijk nauwkeurige wijze te activeren of stilte een specifiek celtype is cruciaal om te begrijpen hoe neurale circuits verwerken verschillende soorten informatie onderliggende emotie en cognitie. Experimentele controle over intacte neurale activiteit loss-/gain-of-function tools (bijvoorbeeld, elektrische stimulatie, farmacologische modulatie, laesie) die niet voorzien in dienst van de selectief nodig voor het regelen van specifieke populaties van neuronen, hetzij op een tijdelijke of ruimtelijke schaal. Direct aanpakken van deze technologische uitdagingen, heeft de ontwikkeling en toepassing van genetisch-codeerbare lichtgevoelige instrumenten neurowetenschappers nodig om de elektrische activiteit van geselecteerde celtypes gedurende welomschreven gedragsmatige gebeurtenissen te controleren. Veel van deze lichtgevoelige eiwitten zijn van microbiële oorsprong, met het licht-gated kation kanaal, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, en het licht-aangedreven chloride pomp, halorhodopsin (NpHR) 2,3, op grote schaal gebruikt.
Een groot voordeel van optogenetics is de mogelijkheid om genetisch doelspecifieke celpopulaties in heterogene hersengebieden en de techniek is met succes toegepast op een aantal modelorganismen (ongewervelde niet-menselijke primaten) 4-6. Veel optogenetic transgene dieren zijn gegenereerd en zijn commercieel verkrijgbaar 7,8 echter oprichting transgene lijnen kan arbeidsintensief en onbetaalbaar zijn. Hier beschrijven we een protocol voor viraal-bemiddelde aflevering van ChR2 en NpHR genen onder de CaMKIIα promotor in ratten prelimbic cortex en dorsale subiculum met een recombinante adeno-geassocieerde virus (AAV) vector. Binnen de voorhersenen, CaMKIIα uitdrukking is exclusief voor glutamaat piramidale neuronen 9. AAV wordt vaak gebruikt voor fundamenteel onderzoek vanwege het relatieve gemak van productie en gebrek aan pathogeniciteit, evenals de sterke en persistent transgenexpressie die is bereikt met deze vectoren 10. Daarnaast schetsen we de stappen en hardware voor gelijktijdige lichte levering en opname in verdoofde-hoofd vast ratten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een breed scala aan technieken beschikbaar zijn voor genetisch-targeting microbiële opsin genen discrete hersengebieden bij knaagdieren. Virale gen delivery biedt een relatief goedkope en snelle aanpak voor het bemiddelen ChR2 en NpHR expressie met celtype-specificiteit. AAV vector systemen zijn een gemeenschappelijke keuze voor gebruik in optogenetic experimenten vanwege de hoge productiekosten titers die tijdens de opslag, het gebrek aan pathogeniciteit en het vermogen om op lange termijn genexpressie 10 produceren stabiel blijven. Veel van de opsin constructen met celtype-specifieke promotors zijn commercieel verkrijgbaar in een verscheidenheid van AAV serotypen van vector kernfaciliteiten zoals de Universiteit van Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) of de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). Een nadeel van AAV-technologie is debeperkte verpakkingscapaciteit (~ 4,7 kb), die een beperking legt op het transgen cassette formaat dat kan worden gebruikt voor de celspecifieke targeting. Als alternatief, lentivirale vectoren, die een grotere verpakkingen capaciteit, kunnen opsin richten onder de controle van grotere promotorsequenties tegemoet.
Het gebruik van een optrode een betrouwbare detectie van elektrofysiologische signalen in combinatie met tijdelijk nauwkeurige levering licht. Zoals hierboven beschreven, echter voldoende zorg nodig in de bouw. Omdat de gesplitste optische vezel is kwetsbaar, het binden van de hechtdraad te strak kan de vezel breken. Hoewel de optrode kan worden gebruikt voor meerdere opnamen moeten de elektrode en optische vezels worden gereinigd (of handmatig gesplitst bij de optische vezel blote einde) voor het inbrengen omdat de impedantie van de elektrode en de kwaliteit van het geleverde licht zal degraderen bij herhaald gebruik.
Tijdens electrophysiological opnamen is het belangrijk dat de optrode langzaam gevorderd. De optrode hier gebruikt heeft ongeveer 350 micrometer dik (wolframelektrode: 125 micrometer; kern van optische vezel: 200 pm) en het verlagen van het snel kunnen leiden tot verplaatsing van hersenweefsel. Licht-geïnduceerde artefacten kunnen eveneens worden overwogen met bijzondere opname en lichte levering set-ups 11-12. Hoewel we vonden geen licht-geïnduceerde artefacten in onze experimentele conditie kan opnamen buiten de getransduceerde hersengebied eventueel worden gebruikt als controle voor lichte voorwerpen. Een andere overweging tijdens het opnameproces is de benodigde lichtintensiteit voor het waarnemen van veranderingen in ChR2-of NpHR expressie neuronen, vooral voor lange duur opnames. Sterke laser intensiteit en lange laser verlichting kan door de weefselschade en / of een verminderde reactie op latere geleverde licht 12-13. Voor gedrags experimenten het gebruik van een controle virale vector is vereist eliminating enig effect door warmte geleverd door de vezel. Voor veel van de commercieel beschikbare optogenetic constructen zijn er aanvullende controle constructen waarin de opsin gensequentie is verwijderd.
Opgemerkt zij dat ontworpen ChR2 varianten met verbeterde eigenschappen en kinetiek ontwikkeld samen met andere silencing opsins die beter geschikt voor bepaalde experimentele bevat 14-15 zijn. Bijvoorbeeld, een nieuwe variant ChR2 ingesteld bij gerichte mutagenese, aangeduid als "Cheta" kan hifi neuronale spiking rijden bij frequenties (tot ten minste 200 Hz) boven die van het oorspronkelijke ChR2 14.
De combinatie van in vivo licht levering en gelijktijdige opname van neuronale respons is een cruciale stap bij het vaststellen van causale verbanden tussen patroon activiteit in genetisch gerichte celpopulaties en overeenkomstige tijd opgesloten gedragsmatige gebeurtenissen. De procedures en hardware hier geschetste bieden een eenvoudige aanpak voor de uitvoering van optogenetics voor in vivo-head vaste opnames bij knaagdieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Drug Abuse (NIDA) subsidie R01 DA24040 (DCC), Universiteit van Colorado Innovatieve Seed Grant (DCC), en NIDA opleiding subsidie T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
