Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов<em> В естественных условиях</em
Summary
Недавнее развитие нейронауки, которые объединяли бы генетику и оптики, называется "Optogenetics", позволяет контролировать нейронной активности замыкания с беспрецедентным уровнем пространственным и временным разрешением. Здесь мы предлагаем протокол для интеграции в записи естественных условиях с optogenetic манипуляции генетически определенных подмножеств префронтальной коры и subicular пирамидальных нейронов.
Abstract
Optogenetic методы появились в качестве мощного инструмента для выяснения нервную деятельность замыкания, лежащую в основе разнообразный набор поведения в широком спектре видов. Optogenetic инструменты микробного происхождения состоят из светочувствительных мембранных белков, которые способны активировать (например, channelrhodopsin-2, ChR2) или тишина (например, halorhodopsin, NpHR) нейронной активности ingenetically определенные типы клеток более поведенчески-соответствующих сроков. Мы сначала продемонстрировать простой подход к аденоассоциированного вирус-опосредованной доставки ChR2 и NpHR трансгенов в спинной подлежащая ткань и прелимбальной области префронтальной коры у крыс. Потому ChR2 и NpHR генетически наведения, мы описываем использование этой технологии для управления электрической активности конкретных популяций нейронов (т.е. пирамидальных нейронов), встроенных в гетерогенной ткани с высоким временным точностью. Мы описываем здесь аппаратную, заказного программного обеспеченияпользовательский интерфейс, и процедуры, которые позволяют одновременной доставки света и электрической записи с трансдуцированные пирамидальных нейронов в наркозом в подготовке естественных условиях. Эти легкие проблематику инструменты предоставляют возможность для выявления причинно-следственные вклады различных типов клеток в обработке информации и поведения.
Introduction
Возможность включения или отключения определенного типа клеток в нервной цепи в временно точного моды имеет решающее значение для понимания того, как нейронные цепи обрабатывают различные типы информации, лежащие в основе эмоций и познания. Экспериментальная контроль над неповрежденной нервной деятельности использовала loss-/gain-of-function инструменты (например, электрическую стимуляцию, фармакологической модуляции, поражение), которые не обеспечивают требуемое выборочно для управления конкретных популяций нейронов, либо на временной или пространственном масштабе. Непосредственно решении этих технологических проблем, разработка и применение генетически кодируемый инструментов светочувствительных позволило неврологи контролировать электрическую активность некоторых типов клеток во время четко определенных поведенческих событий. Многие из этих светочувствительных белков микробного происхождения, с легкой закрытого катионного канала, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, и свет приводом насоса хлорид, halorhodopгрех (NpHR) 2,3, в широко распространенном использовании.
Основным преимуществом Optogenetics является способность генетически целевых конкретных клеточных популяций в гетерогенных областях мозга и техника успешно применяется в ряде модельных организмов (беспозвоночных в приматов) 4-6. Многие optogenetic трансгенные животные были получены и являются коммерчески доступными 7,8, однако, устанавливающие трансгенных линий может быть трудоемким и стоимость слишком высока. Здесь мы опишем протокол для вирусно-опосредованного поставки ChR2 и NpHR генов под CaMKIIα промоутер в крыс прелимбальной коры и спинного подлежащая ткань с помощью рекомбинантной аденоассоциированный вирус (AAV) вектора. В переднем мозге, выражение CaMKIIα является эксклюзивным для глутаматергических пирамидальных нейронов 9. ААВ обычно используется для проведения фундаментальных исследований в связи с его относительной простоты производства и отсутствия патогенности, а также сильные и ПерсиСтент трансген выражение, которое было достигнуто с этими векторами 10. Кроме того мы наметим шаги и оборудование для одновременной доставки света и записи в анестезированных крыс головы фиксированной.
Protocol
Representative Results
Discussion
Широкий спектр методов доступны для генетически таргетирования микробных генов опсина для дискретных областях мозга у грызунов. Вирусный доставки генов обеспечивает относительно недорогой и быстрый подход к посредничество ChR2 и NpHR выражение с камерного типа специфичности. Векторные системы AAV являются общим выбором для использования в optogenetic экспериментов из-за высоких производственных титров, сохраняющих стабильность при хранении, ее отсутствия патогенности и его способности производить долгосрочное экспрессию генов 10. Многие из опсина конструкций с конкретными промоутеров камерного типа имеются в продаже в различных AAV серотипов из векторных основных объектов, таких как в Университете Пенсильвании ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) или университета Северной Каролины в Чапел-Хилл ( http://genetherapy.unc.edu ). Одним из недостатков AAV технологии являетсяограниченные возможности упаковки (~ 4,7 кб), который накладывает ограничение на размер кассеты трансгена, который может использоваться для соты таргетинга. В качестве альтернативы, лентивирусов, которые имеют большую емкость упаковки, способны воспринимать опсина ориентированные под контролем крупных промоторных последовательностей.
Использование в optrode позволяет для надежного обнаружения электрофизиологических сигналов в сочетании с временно-точной подачи света. Как описано выше, однако, достаточно внимание необходимо в его строительстве. Так как оптическое волокно расщепляется хрупка, связывая шовного нить слишком сильно может привести волокно разорвать. Несмотря на то, optrode может быть использован для многократной перезаписи, электрод и оптическое волокно должны быть очищены (или вручную расщепляется в случае оптического волокна свободным концом) перед введением потому что импеданс электрода и качество поставленного света будет деградировать при повторном использовании.
Во элементctrophysiological записи важно, чтобы optrode быть выдвинуты медленно. Optrode используется здесь имеет приблизительно 350 мкм (толщина вольфрамового электрода: 125 мкм; ядро оптического волокна: 200 мкм) и снижение его быстро может привести к движению ткани головного мозга. Светоиндуцированный артефакты также могут быть рассмотрены с особым записи и свет доставки наборах 11-12. Хотя мы не обнаружили светоиндуцированного артефакт в нашей экспериментальной условии, записи вне трансдуцированных области мозга потенциально могут быть использованы в качестве контроля для легких артефактов. Еще одно соображение в процессе записи и есть искомая интенсивность света для наблюдения изменений в ChR2-или NpHR экспрессирующих нейронов, особенно для продолжительности длительной записи. Сильный интенсивность лазерного и долго лазерного освещения может привести к повреждению тканей и / или снижению ответ на последующей поставляемого света 12-13. Для поведенческого эксперимента использование контрольного вирусного вектора требуется для eliminatinг любой эффект за счет тепла, поступающей из волокна. Для многих из коммерчески доступных optogenetic конструкций есть дополнительные управляющие конструкции, в которых последовательность гена опсин было удалено.
Следует отметить, что разработаны варианты ChR2 с улучшенными свойствами и кинетики были разработаны вместе с другими глушителей опсинов, которые могут быть лучше подходят для некоторых экспериментальных вопросов 14-15. Например, новый вариант ChR2 осуществляется через направленного мутагенеза, называется "Cheta", может управлять с высокой точностью воспроизведения нейронов пики на частотах (по крайней мере до 200 Гц) выше, чем у оригинального ChR2 14.
Сочетание в естественных условиях доставки света и одновременной записи нейронных ответов является важным шагом в установлении причинно-следственные связи между рисунком деятельности в генетически-целевых популяций клеток и соответствующих временных автоподстройки поведенческих событий. Процедуры и ха-rdware изложил здесь обеспечивают простой подход для реализации Optogenetics для в естественных условиях головы фиксированной записи у грызунов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом по злоупотреблению наркотиками (NIDA) грант R01 DA24040 (ДКК), Университет Колорадо инновационного Seed Grant (DCC), и NIDA учебного гранта T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
