Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em> In vivo</em
Summary
Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.
Abstract
Optogenetic yöntemler türlerin geniş bir yelpazesinde davranışların çeşitli bir dizi yatan nöral devre aktivitesini ortaya çıkması için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mikrobiyal orijinli optogenetic araçları (örneğin, channelrhodopsin-2, ChR2) veya sessizlik (örneğin, halorhodopsin, NpHR) davranışsal ilgili zaman dilimi zarfında sinirsel aktivite ingenetically tanımlı hücre tiplerini aktive edebiliyoruz ışığa duyarlı zar proteinlerden oluşur. İlk dorsal subikulum ve sıçan prefrontal korteks prelimbic bölgeye ChR2 ve NpHR transgenlerin adeno-ilişkili virüs aracılı verilmesi için basit bir yaklaşımı göstermektedir. ChR2 ve NpHR genetik olarak hedeflenebilir olduğu için, yüksek zamansal hassasiyetle heterojen doku içinde gömülü nöronlar (yani, piramidal nöronlar) spesifik popülasyonlarının elektriksel aktivitesini kontrol etmek için, bu teknolojinin kullanılmasını tarif eder. Biz burada, donanım, özel yazılım açıklamakvivo hazırlanmasında bir anestezi içinde Transdüksiyona piramidal nöronların eş zamanlı ışık teslimat ve elektrikli kayıt için izin kullanıcı arayüzü ve prosedürler. Bu ışık duyarlı araçları bilgi işlem ve davranışlara farklı hücre tiplerinin nedensel katkılarını tanımlamak için fırsat sağlar.
Introduction
Zamansal olarak kesin moda bir sinir devresi içindeki bir hücre tipinin etkinleştirmek veya susturmak için yeteneği nöral devreleri duygu ve biliş altta yatan farklı bilgi türlerini işlemek nasıl anlamak için önemlidir. Bozulmamış sinirsel aktivite üzerinde deney kontrol vermeyen loss-/gain-of-function araçlarını (örneğin, elektrik stimülasyonu, farmakolojik modülasyonu, lezyon) istihdam vardır ya bir zamansal veya mekansal ölçekte, nöronların belirli popülasyonlarının kontrolü için seçici gereklidir. Doğrudan bu teknolojik zorlukları ele, genetik kodlanabilen ışığa duyarlı araçları geliştirme ve uygulama iyi tanımlanmış davranışsal olaylar sırasında select hücre tiplerinin elektriksel aktivitesini kontrol etmek sinirbilimcileri sağladı. Bu ışığa duyarlı proteinlerin bir çok ışık-geçişli katyon kanal channelrhodopsin 2-(CHR2) 1 ve hafif odaklı klorür pompası, halorhodop ile, mikrobiyal kökenligünah yaygın kullanımı (NpHR) 2,3.
Optogenetik önemli bir avantajı, heterojen beyin bölgelerinde genetik hedef spesifik hücre popülasyonlarına yeteneğidir ve tekniği başarılı bir model organizmaların bir dizi (insan olmayan primatlar için omurgasız) 4-6 uygulanmıştır. Birçok optogenetic transgenik hayvanlar olarak üretilir ve 7,8 ticari olarak temin edilebilir, ancak kurulması transjenik soy, yoğun emek gerektirir ve maliyeti engelleyici olabilir edilmiştir. Burada bir rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü kullanılarak sıçan prelimbic korteks ve dorsal subikulum olarak CaMKIIα promotörün kontrolü altında ChR2 ve NpHR genlerin viral aracılı teslim için bir protokol açıklar. Ön beyin içinde, CaMKIIα ifade glutamaterjik piramidal nöronlar 9 özeldir. AAV yaygın nedeniyle göreceli üretimi ve patojenisite eksikliği kolaylığı, hem de temel araştırma için kullanılan güçlü ve persiBu vektörlerin 10 ile elde edilmiştir stent transgen ifadesi. Ayrıca biz anestezi kafa sabit sıçanlarda eşzamanlı ışık teslim ve kayıt için adımlar ve donanım anahat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tekniklerinin geniş bir dizi kemirgenler farklı beyin bölgelerine mikrobiyal opsin genleri genetik hedefleme için kullanılabilir. Viral gen verici hücre tipi spesifikliği olan ChR2 ve NpHR ifade aracılık için nispeten ucuz ve hızlı bir yaklaşım sağlar. AAV vektör sistemleri depolama, patojenli eksikliğine ve uzun vadeli gen ifadesini 10 üretme kabiliyetini esnasında stabil, yüksek üretim titreleri nedeniyle optogenetic deneylerde kullanılmak için ortak bir seçimdir. Hücre tipi özel promotörler ile opsin yapıları çoğu, Pennsylvania Üniversitesi (bir vektör çekirdek tesislerinden AAV serotiplerinin çeşitli ticari olarak temin edilebilir http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) ya da üniversite Chapel Hill Kuzey Carolina ( http://genetherapy.unc.edu ). AAV teknolojiye bir dezavantajıhücre-spesifik hedefleme için kullanılabilir transgen kaset büyüklüğüne bir kısıtlama yerleştirir sınırlı paketleme kapasitesi (~ 4.7 kb). Bir alternatif olarak, daha büyük bir ambalajlama kapasitesi lentiviral vektörler, daha büyük bir promoter dizilerinin kontrolü altında hedef opsin karşılamak mümkün bulunmaktadır.
Bir optrode kullanımı geçici olarak hassas ışık teslimat ile kombinasyon halinde elektrofizyolojik sinyallerin güvenilir bir tespiti sağlar. Yukarıda tarif edildiği gibi, ancak, yeterli bakım yapısında gereklidir. Bölünmüş optik fiber kırılgan olduğu için, çok sıkı dikiş ipliği bağlama elyaf kırılmasına neden olabilir. Verilen ışık elektrot ve kalite empedans düşer, çünkü optrode tekrar kayıt için kullanılabilir olsa da, elektrot ve optik fiber ekleme işleminden önce temizlenir (veya el optik fiber çıplak ucunun durumunda klivaj) olmalıdır tekrarlanan kullanımı ile.
Ele sırasındactrophysiological kayıtları bu optrode yavaş yavaş gelişmiş olması önemlidir. Burada kullanılan optrode yaklaşık 350 um kalınlığa sahiptir (tungsten elektrod: 125 um, optik elyafın çekirdek: 200 um) ve hızlı düşürülmesi beyin dokusu hareketine neden olabilir. Işık kaynaklı eserler de özellikle kayıt ve ışık dağıtım set-up 11-12 ile düşünülebilir. Bizim deneysel durumda ışık kaynaklı objeyi bulundu, ancak, transduse beyin alanının dışında kayıtları potansiyel açık eserler için bir kontrol olarak kullanılabilir. Kayıt işlemi sırasında başka bir husus, özellikle uzun süreli kayıtlar için, ChR2 veya NpHR ifade nöronlar değişikliklerin gözlenmesi için gerekli ışık yoğunluğudur. Güçlü lazer yoğunluğu ve uzun lazer aydınlatma doku hasarı ve / veya sonraki teslim ışık 12-13 azalan bir cevap neden olabilir. Davranışsal deney için bir kontrol viral vektörün kullanımı atılmaya için gereklidirg elyaftan teslim ısı nedeniyle herhangi bir etki. Ticari olarak temin edilebilen optogenetic yapıları çoğu için opsin gen sekansı kaldırıldı birbirini tamamlayan kontrol yapıları vardır.
Bu ChR2 bazı deneysel sorular 14-15 için daha uygun olabilir, diğer susturma opsins birlikte geliştirilmiştir geliştirilmiş özellikleri ve kinetik değişkenler ile tasarlanmış olduğu dikkate alınmalıdır. Örneğin, hedeflenen mutagenesissin yoluyla kurulan yeni bir ChR2 varyant, "Cheta", orijinal ChR2 14 yukarıda (en az 200 Hz kadar) frekanslarda yüksek sadakat nöronal smaç sürebilirim adlandırılır.
In vivo ışık teslimat ve nöronal tepkilerin eş zamanlı kayıt kombinasyonu genetik hedefli hücre popülasyonları ve ilgili zaman kilitli davranışsal olaylar desenli aktivite arasındaki nedensel ilişkileri kurulması önemli bir adımdır. Prosedürler ve haBurada özetlenen rdware, kemirgenlerde in vivo baş sabit kayıtları için optogenetics uygulanması için basit bir yaklaşım sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Uyuşturucu (NIDA) hibe R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Yenilikçi Tohum Grant (DCC) ve NİDA eğitim hibe T32 DA017637 (MVB) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
