وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em> في الجسم الحي</em
Summary
التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف "optogenetics"، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجراة مع التلاعب optogenetic من مجموعات فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية الهرمية الفص الجبهي القشرية ومرفدي.
Abstract
ظهرت أساليب Optogenetic كأداة قوية لتوضيح النشاط العصبي الدائرة الكامنة مجموعة متنوعة من السلوكيات عبر مجموعة واسعة من الأنواع. تتكون أدوات Optogenetic المنشأ الميكروبية للبروتينات غشاء الحساسة للضوء التي هي قادرة على تفعيل (على سبيل المثال، channelrhodopsin-2، ChR2) أو الصمت (على سبيل المثال، halorhodopsin، NpHR) النشاط العصبي أنواع الخلايا المحددة ingenetically الإفراط في الجداول الزمنية سلوكيا ذات الصلة. علينا أن نبرهن أولا مقاربة بسيطة للتسليم بوساطة فيروس الغدة المرتبطة من ChR2 وNpHR الجينات المحورة إلى مرفد الظهرية ومنطقة الحوف من قشرة الفص الجبهي في الفئران. لأن ChR2 وNpHR هي للاستهداف وراثيا، نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لمراقبة النشاط الكهربائي للسكان محددة من الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية الهرمية) جزءا لا يتجزأ من نسيج غير متجانس مع دقة زمنية عالية. وصفنا هنا الأجهزة والبرامج المخصصةواجهة المستخدم، والإجراءات التي تسمح للتسليم في وقت واحد وتسجيل الضوء الكهربائية من الخلايا العصبية الهرمية transduced في تخدير في إعداد الجسم الحي. توفر هذه الأدوات للضوء استجابة الفرصة لتحديد المساهمات السببية من أنواع مختلفة من الخلايا لمعالجة المعلومات والسلوك.
Introduction
القدرة على تفعيل أو إسكات نوع خلية معينة داخل الدوائر العصبية بطريقة دقيقة زمنيا هو أمر حاسم لفهم كيفية معالجة الدوائر العصبية أنواع مختلفة من المعلومات الكامنة العاطفة والإدراك. السيطرة التجريبية على النشاط العصبي سليمة وقد استخدمت أدوات loss-/gain-of-function (على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي والتشكيل الدوائية، الآفة) التي لا توفر المطلوب انتقائي للسيطرة على فئات معينة من السكان من الخلايا العصبية، إما على نطاق والزمانية أو المكانية. معالجة هذه التحديات التكنولوجية مباشرة، وقد مكن تطوير وتطبيق أدوات حساسة للضوء وراثيا encodable علماء الأعصاب للسيطرة على النشاط الكهربائي من أنواع الخلايا حدد خلال الأحداث السلوكية واضحة المعالم. العديد من هذه البروتينات الحساسة للضوء هي من أصل الميكروبية، مع قناة بوابات ضوء الموجبة، channelrhodopsin-2 (ChR2) 1، ومدفوعة ضوء مضخة كلوريد، halorhodopالخطيئة (NpHR) 2،3، في الاستخدام واسع النطاق.
والميزة الرئيسية لoptogenetics هو القدرة على السكان الخلية وراثيا هدف محدد في مناطق الدماغ غير متجانسة ولقد تم تطبيق هذه التقنية بنجاح لعدد من الكائنات نموذج (اللافقاريات إلى الرئيسيات غير البشرية) 4-6. وقد ولدت كثير من الحيوانات المعدلة وراثيا optogenetic ومتاحة تجاريا 7،8، ولكن يمكن إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تكون كثيفة العمالة وباهظة التكلفة. نحن هنا وصف بروتوكول للتوسط فيروسي التسليم من ChR2 وNpHR الجينات تحت المروج CaMKIIα في الفئران الحوف القشرة الظهرية ومرفد باستخدام الغدة المرتبطة المؤتلف الفيروس (AAV) المتجه. داخل الدماغ الأمامي، CaMKIIα التعبير هي حصرية لالخلايا العصبية الهرمية الجلوتاميرجي 9. ويستخدم عادة لAAV البحوث الأساسية بسبب السهولة النسبية لإنتاجه وعدم المرضية، وكذلك قوي وPERSIالدعامة التعبير التحوير الذي تم تحقيقه مع هذه النواقل 10. بالإضافة إلى ذلك نحن الخطوط العريضة للخطوات والأجهزة للتسليم الضوء في وقت واحد وتسجيل في الفئران الثابتة الرأس تخدير.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتوفر لراثيا استهداف الجينات الميكروبية أوبسين إلى مناطق الدماغ منفصلة في القوارض وهناك مجموعة واسعة من التقنيات. يوفر توصيل الجينات الفيروسية نهج غير مكلفة نسبيا وسريعة للوساطة ChR2 وNpHR التعبير مع خلية من نوع خصوصية. نظم ناقلات AAV هي خيار مشترك للاستخدام في التجارب optogenetic بسبب التتر الإنتاج العالية التي تبقى مستقرة أثناء التخزين، افتقارها إلى المرضية، وقدرتها على إنتاج طويلة الأجل التعبير الجيني 10. العديد من بنيات أوبسين مع المروجين محددة الخلايا من نوع المتاحة تجاريا في مجموعة متنوعة من الأنماط المصلية AAV من المرافق الأساسية مثل ناقلات جامعة بنسلفانيا ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) أو جامعة من ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل ( http://genetherapy.unc.edu ). عيب واحد لتكنولوجيا AAV هوقدرة محدودة التعبئة والتغليف (~ 4.7 كيلو بايت)، الأمر الذي يضع قيدا على حجم الكاسيت التحوير التي يمكن استخدامها لاستهداف خلية محددة. كبديل، ناقلات lentiviral، والتي لديها قدرة أكبر التعبئة والتغليف، هي قادرة على استيعاب أوبسين تستهدف تحت سيطرة تسلسل المروج أكبر.
استخدام وسيلة optrode يسمح للكشف عن الإشارات الكهربية يمكن الاعتماد عليها في تركيبة مع تسليم ضوء زمنيا الدقة. كما هو موضح أعلاه، ومع ذلك، هناك حاجة إلى رعاية كافية في بنائه. منذ الألياف البصرية المشقوق لا يزال هشا، وربط خيوط الجروح بإحكام شديد قد يتسبب في الألياف للكسر. على الرغم من أن optrode يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات متعددة، يجب تنظيف القطب والألياف البصرية (أو يدويا المشقوق في حالة نهاية العارية الألياف البصرية) قبل الإدراج لأن مقاومة من القطب ونوعية الضوء تسليمها سوف تتحلل مع الاستخدام المتكرر.
خلال ايلىتسجيلات ctrophysiological من المهم أن تكون متقدمة optrode ببطء. وoptrode المستخدمة هنا ما يقرب من 350 ميكرون سمك (التنغستن القطب: 125 ميكرومتر؛ الأساسية للألياف البصرية: 200 ميكرون) وخفض ذلك بسرعة قد يؤدي إلى حركة أنسجة المخ. كما يمكن اعتبار القطع الأثرية التي يسببها الضوء، مع تسجيل خاص وتسليم ضوء مجموعة عمليات 11-12. على الرغم من أن لم نجد أي قطعة أثرية الناجم عن ضوء في حالة تجريبية لدينا، والتسجيلات خارج منطقة الدماغ transduced يمكن أن تستخدم كجهاز تحكم عن التحف الخفيفة. اعتبار آخر أثناء عملية التسجيل هو شدة الضوء اللازمة لمراقبة التغيرات في ChR2 أو NpHR، معربا عن الخلايا العصبية، وخاصة بالنسبة للتسجيلات مدة طويلة. قوية كثافة الليزر والإضاءة الليزر طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة و / أو استجابة لاحقة انخفض ضوء تسليمها 12-13. للتجريب السلوكية مطلوب استخدام ناقل فيروسي التحكم عن eliminatinز أي تأثير بسبب الحرارة تسليمها من الألياف. بالنسبة للعديد من بنيات optogenetic المتاحة تجاريا هناك ثوابت تحكم التكميلية التي تمت إزالة التسلسل الجيني أوبسين.
تجدر الإشارة إلى أن المهندسة ChR2 المتغيرات مع تحسين خصائص وحركية وضعت جنبا إلى جنب مع opsins إسكات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية 14-15. على سبيل المثال، وهو البديل ChR2 الجديدة التي أنشئت عن طريق الطفرات المستهدفة، ووصف "ChETA"، يمكن أن تدفع عالية الدقة ارتفاعه العصبية بترددات (حتى لا يقل عن 200 هرتز) أعلاه أن من ChR2 الأصلي 14.
مزيج من الضوء في الجسم الحي تسليم وتسجيل وقت واحد من الاستجابات العصبية هو خطوة حاسمة في إقامة علاقات سببية بين النشاط منقوشة في السكان الخلية المستهدفة وراثيا والأحداث السلوكية المقابلة غير الساحلية الوقت. الإجراءات وهاrdware المذكورة هنا توفير نهج واضحة لتنفيذ optogenetics لفي الجسم الحي تسجيلات الثابتة الرأس في القوارض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) منحة R01 DA24040 (DCC)، جامعة كولورادو مبتكرة غرانت البذور (DCC)، والنداء منحة التدريب T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
