糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

1。サンプル調製およびスキャン 1.1試料の調製以前に説明したように7以下の手順は基本的に行われます。 膵臓を収穫。タンパク質分解を避けるために、氷冷PBSを使用しています。 2〜3時間のために氷の上でPBS中4％PFAで組織を固定します。ローブが固定時に "広がって"いることを確認してください。これは、再建後の解剖学的ランドマークの識別を容易にするでしょう。 30分間過剰のPBSで洗浄します。 メタノール中で段階的に膵臓（33、66％、100％）、15分/ステップを脱水する。これは、漂白時に気泡の形成を最小限に抑えます（ステップ5を参照）と、凍結融解時の細胞破壊を防ぎます（ステップ7を参照）。 H 2 O 2：作りたてのMeOH中の組織をインキュベートDMSOは、内因性の組織の蛍光を消光するため、24時間、室温で2時01分03秒の割合でバッファを漂白。新しいbleachiに大きなサンプル、交換のための別の24時間ngのバッファとインキュベート。 ON、過剰MeOHで洗浄します。 -80に少なくとも5サイクルの凍結融解℃ – 室温抗体の浸透を容易にする。 TBST（33、66％、100％）、15分/ステップに戻って段階的に水分補給を。 室温で12〜24時間の場合は10％血清（できれば二次抗体が生成された同じ種から）、5％DMSOおよび0.01％NAAZとTBST中ブロック RTで、48時間ブロッキングバッファーで一次抗体と共にインキュベートし、大きなサンプル（ここで使用される抗体は、試薬の表に記載されている）のための72時間に及ぶ。 ON、過剰TBSTで洗浄します。 48時間蛍光標識二次抗体とインキュベートし、室温で、より大きなサンプルのための72時間に及ぶ。 ON、過剰TBSTで洗浄します。 1.2 次の手順では、アガロースでサンプルをマウントして、カスタムメイドの試料ホルダー（ 図7を参照にアタッチする方法を説明します）スキャンをオプトインする前に。 Hörnblad ら 3に図3Aを参照するに従って、脾臓、十二指腸と胃のローブを分離します。ローブ間の関係はさらにHörnblad ら 11で明らかにされています。 1.5％（w / v）のdH 2 Oで、フィルター内の低融点アガロースを準備し、37まで冷まし℃、洗剤を洗い流し、氷の上にアガロース埋め込 ​​む前に、気泡を除去するためのdH 2 O中の組織をすすいでください。 あなたのサンプルを囲むアガロースブ​​ロックを切り出してサンプルとアガロースのベースとの間に約1cmのスペーサーを残す。光の散乱を低減するためにアガロースブ​​ロックのシャープなエッジを（≤90°）をトリムします。 時間は、各ステップ間で平衡化することができますし、MeOH（33、66％、100％）で段階的にサンプルを脱水。試料が沈むとき、それは平衡化であると考えられている。 ベンジルベンツ：ベンジルアルコールの1:2溶液中の試料をクリアそれが透明になるまでオエート（Babbの）。さらに12時間のためのExchange Babbのソリューションとインキュベートする。 サンプルホルダーにクリアサンプルを置き、ホルダーのフランジで開けた穴を介して、アガローススペーサを介して2本の針を挿入して固定します。 Babbの決済ソリューションでいっぱいにキュベットに注入し、スキャナと沈めることでサンプルを置きます。膵臓のシリーズを比較する場合、同じ倍率はすべてのスキャンに使用されるべきです。倍率は、シリーズの最大のサンプルのために最適化されるべきである。 ARで試料の1.3ポジショニング次のプロトコルは、正確に、COM-ARアルゴリズムを使用してサンプルを配置する手順について説明します。 ROIが全体の標本が含まれている場合、この手順にのみ適用されます。アルゴリズムの詳細については、Cheddad ら 2を参照してください。 ボットのための2つの位置で試料の画像を取得解剖学と信号チャネルh。最大投影面積、および90°（Z軸に関連付けられている）の位置2を表示0°（X軸に関連付けられている）の位置1。我々は解剖学を視覚化するためにGFPのチャネルを使用しています。 しきい値に解剖画像上にROIの期待値最大化（EM）アルゴリズムを適用します。 0°と90°の突起の両方に対して、ステップ2で得られた2値画像のCOM点（x座標）を計算します。 0°および信号チャネルの90°の画像にステップ3で計算識別されるCOM点を通る垂直線を重ね合わせる。 参照は、視野の中心線は、試料の発見のCOM点を通過するように、サンプルを移動するように手順4で取得した画像を使用してください。 1.4スキャニング飽和することなく可能対雑音比が最も高い信号を達成するために露光時間を調整します投影画像の影はどの分野。スキャンされるすべてのチャネルに対して、この手順を繰り返します。 スキャンされた最初の蛍光チャンネル用のフィルタセットを選択します。短いのλフルオロフォアからの発光はもはやλと蛍光体を励起し、それによって退色を引き起こす可能性があります。この可能性を最小限に抑えるには、まず一番長い励起λの蛍光体をスキャンしてください。 各チャンネルの垂直軸に沿って試料を回転、360°以上のサンプルを照らす、蛍光シグナルを収集するためにシャッターを開きます。 NIR-OPTのセットアップに使用するステップ角は0.9°とBioptonics 3001スキャナ0.45°用です。 次のチャネルに適したフィルタを選択し、上記のように進みます。 2。計算処理と復興 2.1ポスト買収ずれ検出および訂正（値のチューニング） 投影トモグラフィーでは、それは一般的に必要である前に復興への回転軸に沿って画像の位置を微調整するための投影にポストアラインメント値を割り当てることができます。しかし、光軸に向かってカメラの角度の小さな収差は、サンプルの長さに沿って不均一-値を引き起こす可能性がありますので、幾何学的な歪みを誘発する。このような歪みを避けるためには、標本全体にわたって正確かつ統一された後のアライメント値（値）を見つけるための計算方法は2を適用することができる。 8ピクセルの高さのブロックに0で特定の信号を投写°と180°に分割し、各ブロック間のx軸に沿ってシフト（A値）を計算するために、離散フーリエ変換を使用しています。 試験片の長さ方向に沿ってx軸シフトの傾きを説明角度θ 'を計算するために、回転中心点を見つけるために線形最小二乗回帰を適用します。 すべてのプロジェクトは移行を回転させることにより、スキャン中にズレを補正するため回転中心点の周りctionsθ '/ 2。 2.2コントラスト限られた適応ヒストグラム均等化（CLAHE） 再建および/または定量的評価のためのセグメンテーション時に "アウトしきい値処理"される危険にさらされている非常に弱い信号を呈するオブジェクト（膵島）の検出とセグメンテーションを容易にするために、CLAHEアルゴリズムは投影画像にも適用することができる。 CLAHE操作は2つの主要な強度変換して実行されます： 局所的なコントラストが推定され、投影画像の非重複ブロック内で均一化される。 強度はその後バイリニア補間によるブロック間の境界領域で正規化されます。 名前コントラストは、画像に限られた飽和画素を避けるために設定されているクリップの制限を参照しています。このプロトコルでは、MATLABは、組み込み関数"adapthisteq"が使用され、デフォルトのcを使用して適用された 0.01のリップ制限と256のタイルサイズ。ノートでは、最適なタイルサイズは、経験的にテストする必要があると分析された試料に応じて変えることができる。アルゴリズムと例の詳細については、Hörnblad ら 3に記載されています。 注意！上記の計算処理手順の標準的なアルゴリズムに基づいて構築されていて、MATLAB（MathWorks社）で実行されます（COM-AR-ValueのチューニングとCLAHE含むが、1.3から2.2を参照）。 2.3断層復興と等値面の描画フィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して、修正し、正規化された画像は、すぐに統一されたずれ補正とダイナミックレンジを最適化するための最小限の要件を再構成することができる。このプロトコルでは、すべての再建はNReconソフトウェア（Skyscan）、バージョン1.6.8（で利用できるフィルタ補正逆投影法を用いて行われる= "_blank"> http://www.skyscan.be/products/downloads.htm）。平行ビーム形状を撮像セットアップで実装されていない限り、注意、画像化されたオブジェクトの倍率はレンズの焦点からの距離に依存します。したがって、NReconソフトウェアに投影データセットをインポートするとき、それは、添付のソースの距離（mm）とスキャナの回転方向（反時計回り入力 "CC"のため、時計回り入力 "CW"の場合）に正しいオブジェクトを含めることが重要です再建中にコーンビーム誘起アーチファクトを避けるために、ファイルをログに記録します。 得られた仮想セクションのスタックを可視化し、定量化するために、ImarisまたはVolocityなどの適当な画像処理ソフトを使って3Dの等値面を生成します。 マウス膵島の単離および移植手順がMIAM大学が見直され、承認されたプロトコルの下で糖尿病研究所の臨床細胞プロセッシングおよびトランスレーショナルモデル·コアで行われた私は施設内動物のケアと使用委員会。動物の研究のための倫理委員会、スウェーデン北部では、動物を含む他のすべての実験を承認した。