Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research
Summary
Descriviamo l'adattamento della tomografia ottica di proiezione (OPT)<sup> 1</sup> All'imaging nello spettro dell'infrarosso vicino, e l'attuazione di una serie di strumenti di calcolo. Questi protocolli consentire una valutazione della pancreatica β-cellulare di massa (BCM) in esemplari più grandi, aumentare la capacità multicanale della tecnica e aumentare la qualità dei dati OPT.
Abstract
Adattando OPT per includere la capacità di imaging nel vicino infrarosso (NIR) dello spettro, si illustrano qui la possibilità di corpi immagine più grande di tessuto pancreatico, come il pancreas di ratto, e per aumentare il numero di canali (tipi cellulari) che possono essere studiato in un singolo campione. Approfondiremo l'attuazione di una serie di strumenti di calcolo che forniscono: posizionamento 1 / accurata di un campione (nel nostro caso il pancreas) centro di massa (COM) in corrispondenza dell'asse di rotazione (AR) 2; 2 algoritmi / perfezionati per posta -messa a punto di allineamento che impedisce distorsioni geometriche durante la ricostruzione tomografica 2 e 3 / un protocollo per l'equalizzazione per aumentare l'intensità del segnale ai rapporti di rumore in OPT-based determinazioni BCM 3. Inoltre, si descrive un porta-campioni che minimizza il rischio di movimenti accidentali del campione durante l'acquisizione dell'immagine. Insieme, questi protocolli consentire una valutazione della distribuzione del BCM e OTHcaratteristiche er, da svolgersi in tutto il volume del pancreas intatta o altri organi (ad esempio, in studi di trapianto di isole), con una risoluzione fino al livello dei singoli isolotti di Langerhans.
Introduction
L'insulina producono β-cellule sono fondamentali per la capacità del corpo per controllare il glucosio nel sangue omeostasi. Pertanto, le valutazioni di distribuzione del pancreas BCM sono indispensabili per molte aree di ricerca pre-clinica del diabete. Nelle valutazioni dei regimi terapeutici, ad esempio, l'impatto di ablazione genica mirata sulla differenziazione delle cellule del sistema endocrino o su studi di eziologia del diabete in modelli di roditori per la malattia spesso dipendono da tali analisi. Tradizionalmente, questi tipi di valutazioni sono affidati a tempo consumando stereologica approcci che sono difficili da eseguire a causa delle dimensioni e complessa costituzione anatomica del pancreas. La maggior parte di imaging ad alta risoluzione approcci attualmente (tipicamente ottico), non forniscono una profondità sufficiente a consentire la penetrazione di imaging intero pancreas nei roditori. Al contrario, gli approcci di imaging che non si limitano con la loro profondità di penetrazione (tipicamente nucleare) fornire a bassa risoluzione per risolvere la distribuzione completa e BCM sono ostacolatidalla mancanza di mezzi di contrasto adeguati 4,5.
Tomografia a proiezione ottica è una modalità di imaging 3D che consente ad alta risoluzione valutazioni di campioni biomedici sulla scala mm a cm 6. Con la presente, le informazioni sulla posizione spaziale e il volume del individuale di insulina esprimere isole di Langerhans possono essere estratte in tutto il volume del pancreas in topi normali e diabetici 3,7-10. Lo scopo di questo studio è di migliorare ulteriormente la capacità di questa tecnica per la valutazione delle β-cellule pancreatiche; loro distribuzione endogena, quando innestato in altri tessuti, la loro relazione con altri costituenti pancreatici (come infiltrarsi tipi cellulari) e in grande preparazioni pancreatiche rispetto al passato.
Il vicino infrarosso tomografia ottica di proiezione (NIR-OPT) di installazione
In seguito protocolli, uno scanner OPT in base al set up originale descritto da Sharpe <em> 1 et al, atto a imaging nel vicino infrarosso descritto ed utilizzato. Per valutazioni singolo canale del pancreas mouse (es. BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner può essere utilizzato.
Una lampada ad alogenuri metallici che fornisce energia di eccitazione superiore una lampada a mercurio a lunghezze d'onda superiori a 650 nm, fornisce la luce di eccitazione. La luce viene trasferita attraverso una guida di luce liquida. Una utile combinazione di fluorocromi e filtri passa banda per NIR fluorescenza imaging e separazione dei canali sono mostrati in Figura 3. La luce emessa viene rilevata con una telecamera CCD retroilluminato, con alta efficienza quantica nello spettro NIR. La scansione OPT è automatizzata utilizza una piattaforma LabView che controlla la fotocamera e motore passo-passo. Per supportare campioni nella dimensione di pancreas di ratto intatto, uno specchio d'argento rivestito e protetto da una cuvetta grande viene utilizzata. Infine, un porta-campioni che elimina indesiderate movemen verticalits del campione durante la scansione creata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche descritte per l'imaging OPT consente l'estrazione di parametri spaziali e quantitativi in tutto il volume del pancreas murino. A causa di limitazioni nella risoluzione ottenibile per questo tipo di immagini si mesoscopica va notato che, come per la maggior parte delle modalità di imaging, più grande è il campione inferiore della risoluzione (Anche se l'uso di una risoluzione CCD superiore dovrebbe aumentare la risoluzione della scansione OPT) . Quindi, per la valutazione dei lobi intatti topo pancreatici, la tecnica al momento non fornisce sola risoluzione cella anche se vicino (circa 15-20 micron) 7. Ancora, per l'estrazione di distribuzione BCM nel pancreas topo protocolli hanno fornito dati che più ben corrispondono a quelli ottenuti dal punto esempio contando morfometria 3,13 Si segnala che, sebbene implementazione del protocollo CLAHE permette di individuare isolotti significativamente più , queste isole sono generalmente più piccole e non contributite sostanzialmente ai complessivi β-cellule volumi.
I protocolli immunoistochimici coinvolte sono relativamente lunghe (fino a due settimane), ma le mani reali in tempo per la preparazione dei campioni è breve e quindi la tecnica è adatto per lo studio di grandi coorti di animali 9. Se il potenziale di distribuzioni eterogenee è un punto di riferimento per l'indagine, va sottolineato che occorre prestare attenzione nella procedura relativa fissaggio e montaggio per evitare che il tessuto pancreatico si fissa in senso sfavorevole e un piatto ("stese" ) supporto del tessuto deve essere cercato per agevolare tali valutazioni.
Un importante problema quando si esegue OPT COM è che il campione è fissata in corrispondenza dell'asse di rotazione e che non si muove, verticalmente o orizzontalmente, durante la procedura di scansione. Pertanto, è essenziale avere una configurazione meccanica stabile ed un sistema ben funzionante per attaching il campione. Abbiamo risolto il problema con la costruzione di un supporto nuovo (Figura 7).
Geometria parallela non era vero per il nostro NIR-OPT o Bioptonics 3001 scanner, che è stato rilevato come spostamento verticale tra la schiena e posizioni anteriori di oggetti periferici nelle immagini registrate proiezione. Regolando l'oggetto a distanza di sorgente nel file di log dello scanner corrispondente (vedi 2.3.1) si potrebbe migliorare sensibilmente la qualità dei nostri dati e correggere le distorsioni geometriche ai bordi più esterni delle immagini di proiezione, che è di particolare importanza quando valutazione più grandi campioni.
Nel protocollo attuale, forniamo una proposta di set di filtri che permettono la visualizzazione di tre diversi canali specifici e un canale "anatomia" nelle valutazioni di preparazioni pancreatiche intatti. Ovviamente queste impostazioni può essere modulata per meglio adattarsi alle fluorocromi utilizzati per un determinato studio, anche se, come per tutte le forme di fluorescenzamicroscopia cento, il rischio potenziale del segnale sanguinare-through deve essere attentamente valutato. Lo studio di isolette insulina marcata con fluorocromi eccitati sopra 750 nm non è stato ancora possibile da noi utilizzando la lampada ad alogenuri metallici che il nostro set up utilizza. E 'possibile che una telecamera con ancora maggiore efficienza quantica nelle lunghezze d'onda pertinenti in combinazione con fonti alternative di luce (ad esempio diodi laser) potrebbe aumentare il potenziale di NIR-OPT ulteriormente ea permettere l'imaging a lunghezze d'onda ancora più elevati.
OPT immagini è una tecnica estremamente versatile per le valutazioni spaziali e quantitative di campione biomedici sul mm cm scala. Anche se i protocolli qui presentati sono stati sviluppati con lo scopo principale del pancreas / diabete di ricerca che dovrebbe essere possibile tradurre la ricerca su altre specie, tipi di campioni e marcatori. Con la possibilità di visualizzare diversi canali distinti in preparazioni pancreatiche intatti, NIR-OPT immagini fLTERIORI ha il potenziale come strumento per valutare la specificità assorbimento di agenti di contrasto destinati non invasivi valutazioni da altre modalità di imaging, purché questi agenti di contrasto possono essere destinate a svolgere anche un fluoroforo rilevabile da OPT.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. P. Lindström è riconosciuto per la fornitura di topi ob / ob. J. Lehtonen è riconosciuto per l'assistenza con la produzione video e J. Gilbert aiuto con l'editing. Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti del Diabetes Research Institute Foundation (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), la Commissione europea (FP-7, convenzione di sovvenzione n.: CP-IP 228933-2) (JS e UA), le Fondazioni Kempe, Università di Umea e il Consiglio svedese della ricerca a UA
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
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- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
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