Nabij Infrarood Optische projectie Tomografie voor de beoordeling van β-cel Massa Distributie in Diabetes Research
Summary
We beschrijven de aanpassing van optische projectie tomografie (OPT)<sup> 1</sup> Om beeldvorming in de nabij-infrarode spectrum, en de implementatie van een aantal computationele gereedschappen. Deze protocollen kunnen evaluaties van pancreatische β-celmassa (BCM) in grotere exemplaren, verhoging van de multichannel capaciteit van de techniek en de kwaliteit van de OPT-gegevens.
Abstract
Door aanpassing OPT de capaciteit van imaging in het nabije infrarood (NIR) spectrum bevatten we hier illustreren de mogelijkheid om opname groter organen van pancreasweefsel, zoals de rat pancreas en het aantal kanalen (celtypen) dat afhankelijk worden bestudeerd in een monster. We beschrijven verder de uitvoering van een aantal computerhulpmiddelen die voorzien: 1 / nauwkeurige positionering van (in ons geval de pancreas) een exemplaar massamiddelpunt van (COM) op de rotatieas (AR) 2, 2 / verbeterde algoritmen voor post -alignment tuning die geometrische vervormingen voorkomt tijdens de tomografische reconstructie 2 en 3 / a protocol voor egalisatie intensiteit te verhogen signaal-ruisverhoudingen in OPT gebaseerde bepalingen BCM 3. Daarnaast beschrijven we een monsterhouder dat het risico voor onbedoelde bewegingen van het model minimaliseert tijdens beeldacquisitie. Samen vormen deze protocollen kunnen evaluaties van BCM distributie en anderener functies worden uitgevoerd binnen de omvang van intact pancreata of andere organen (bijv. in studies van eilandjestransplantatie), met een resolutie tot op het niveau van individuele eilandjes van Langerhans.
Introduction
De insuline producerende β-cellen toets vermogen van het lichaam om bloed glucose homeostase controleren. Daarom evaluaties van de alvleesklier BCM distributie zijn noodzakelijk om veel gebieden van pre-klinische onderzoek naar diabetes. In evaluaties van therapeutische regimes bijvoorbeeld het effect van gerichte gen ablatie op endocriene celdifferentiatie of studies van diabetes etiologie in diermodellen voor de ziekte vaak afhangen van analyses. Traditioneel zijn deze soorten beoordelingen aangevoerde tijdrovend Stereologische benaderingen moeilijk vanwege de grootte en complexe anatomische samenstelling van de pancreas voeren. De meeste hoge resolutie imaging methoden op dit moment (meestal optisch), niet voldoende indringdiepte op hele alvleesklier beeldvorming mogelijk bij knaagdieren. Omgekeerd imaging benaderingen die niet zijn beperkt door hun penetratiediepte (typisch kern) aan arme oplossing van het volledige BCM distributie lossen en worden belemmerddoor het gebrek aan adequate contrastmiddelen 4,5.
Optische projectie tomografie is een 3D-beeldvormende modaliteit die een hoge resolutie evaluaties van biomedische maakt op de mm tot cm schaal 6. Hierdoor kan informatie over de ruimtelijke positie en volume van de afzonderlijke insuline expressie eilandjes van Langerhans worden geëxtraheerd door het volume van de pancreas in normale en diabetische muizen 3,7-10. Het doel van deze studie is verder de capaciteit van deze techniek voor de beoordeling van pancreatische β-cellen, hun endogene verdeling bij geënt in andere weefsels, hun verhouding tot andere bestanddelen pancreas (zoals infiltreren celtypes) en in grotere pancreas voorbereidingen dan voorheen mogelijk was.
De nabij-infrarood optische projectie tomografie (NIR-OPT) setup
In de onderstaande protocollen, een scanner OPT gebaseerd op de oorspronkelijke opstelling beschreven door Sharpe <em> et al 1, aangepast aan imaging in het nabije infrarood bereik wordt beschreven en gebruikt. Voor een kanaal evaluaties van de muis pancreas (bijvoorbeeld van BCM), kan de SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner worden gebruikt.
Een metaalhalogenidelamp die hogere excitatie energie dan een kwik-booglamp biedt bij golflengten boven 650 nm, levert het excitatielicht. Het licht wordt overgebracht door middel van een vloeistof lichtgeleider. Een bruikbare combinatie van fluorochromen en banddoorlaatfilter voor NIR fluorescentie beeldvorming en kanaalscheiding worden getoond in Figuur 3. Het uitgezonden licht wordt gedetecteerd met een achterzijde verlichte CCD camera met hoog kwantumrendement in het NIR spectrum. Het OPT scannen wordt geautomatiseerd met behulp van een LabView platform dat de camera regelt en stappenmotor. Monsters in de grootte van intacte rat pancreata, een beschermde verzilverde spiegel en een grote cuvette ondersteund wordt. Tot slot, een monsterhouder die ongewenste verticale movemen elimineertts van het monster tijdens de scan is ontworpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven technieken voor OPT imaging maakt winning van ruimtelijke en kwantitatieve parameters gehele volume van de muizen pancreas. Vanwege beperkingen in haalbare resolutie voor dit type mesoscopische beeldvorming moet worden opgemerkt dat, zoals voor de meeste beeldvormende technieken, hoe groter het monster lager de resolutie (Hoewel het gebruik van een hogere resolutie CCD de resolutie van de scan OPT verhogen) . Derhalve voor de beoordeling van intacte alvleesklier muis lobben, is de techniek thans geen enkele cel resolutie maar dicht (ca. 15-20 pm) 7. Toch voor de extractie van BCM verdeling in de muis pancreas protocollen hebben data die meer dan ook die verkregen door bijvoorbeeld puntentelling morfometrie 3,13 passende Er zij opgemerkt dat, hoewel de uitvoering van het protocol CLAHE maakt detectie van aanzienlijk eilandjes Deze eilandjes zijn over het algemeen kleiner en niet bijdragente hoofdzaak de algemene β-cel volumes.
De betrokken immunohistochemische protocollen relatief lang (tot twee weken), maar de werkelijke handen op tijd prepareren is kort en dus de techniek is geschikt voor de studie van grote cohorten dieren 9. Wanneer het potentieel van heterogene distributie patronen is een focus voor het onderzoek, moet worden benadrukt dat de zorg moet worden genomen in de stappen met betrekking tot fixatie en montage te voorkomen dat de pancreas weefsel wordt gefixeerd in een ongunstige manier en een platte ("uitgespreid" ) berg van het weefsel moet worden nagestreefd om dergelijke beoordelingen te vergemakkelijken.
Een belangrijk probleem bij het uitvoeren van OPT is dat de steekproef de COM is vastgesteld op de rotatie-as en dat het niet beweegt, verticaal of horizontaal, tijdens de scanprocedure. Daarom is het essentieel te beschikken over een stabiele mechanische setup en een goed functionerend systeem voor attaching van het monster. We opgelost door de bouw van een nieuwe mount (Figuur 7).
Parallel geometrie gold niet voor onze NIR-OPT of Bioptonics 3001 scanner, die werd gedetecteerd als een verticale verschuiving tussen de achter-en voorkant posities van de perifere objecten in de opgenomen projectie beelden. Door de object source afstand in het logbestand van de betreffende scanner (zie 2.3.1) we aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van de data en corrigeert geometrische vervormingen aan de andere randen van de projectiebeelden, hetgeen van bijzonder belang wanneer beoordelen grotere specimens.
In het huidige protocol, bieden we een suggestie van filtersets dat visualisatie van drie verschillende specifieke kanalen en een "anatomie" kanaal in de beoordelingen van de intacte alvleesklier voorbereidingen mogelijk te maken. Uiteraard deze instellingen kunnen worden gemoduleerd om beter passen bij de fluorochromen gebruikt voor een bepaalde studie, hoewel, net als bij alle vormen van fluorescentiecent microscopie, moet het potentiële gevaar van het signaal doorbloeding zorgvuldig worden geëvalueerd. De studie van insuline gelabeld eilandjes met fluorochromen die zijn verheugd boven 750 nm is nog niet mogelijk geweest door ons met behulp van de metalen halide lamp dat onze set-up gebruikt. Het is mogelijk dat een camera met nog hogere kwantumrendement in de relevante golflengten in combinatie met alternatieve lichtbronnen (bv. diode lasers) zou de mogelijkheden van NIR-OPT verder vergroten en voor het afbeelden van nog hogere golflengten.
OPT beeldvorming is een zeer veelzijdige techniek voor ruimtelijke en kwantitatieve beoordelingen van biomedisch specimen op de mm-cm schaal. Hoewel de protocollen die hier zijn ontwikkeld voor het hoofddoel van pancreas / diabetes research moeten zij worden vertaald naar andere soorten onderzoek, specimen en types markers. Door de mogelijkheid om een aantal verschillende kanalen te visualiseren in intacte alvleesklier preparaten, NIR-OPT beeldvorming fERDERE heeft de potentie als middel om de opname specificiteit van contrastmiddelen voor niet-invasieve evaluatie van andere beeldvormingsmodaliteiten zolang deze contrastmiddelen kunnen worden ontworpen om een fluorofoor dragen ook detecteerbaar met OPT evalueren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr P. Lindström wordt erkend voor het verschaffen van ob / ob muizen. J. Lehtonen is erkend voor hulp bij videoproductie en J. Gilbert voor hulp bij het bewerken. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Diabetes Research Institute Foundation (AP), de Juvenile Diabetes Research Foundation (AP en UA), de Europese Commissie (FP-7, Subsidieovereenkomst nr.:. CP-IP +228,933-2) (JS en UA), de Kempe Stichtingen, Umeå Universiteit en de Zweedse Research Council om UA
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
